付梅， 申春琴， 汪政希， 劉梅， 姚維志， 原居林， 彭希文， 呂紅健

1. 西南大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院/淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江上游水生生物多樣性保護研究中心，重慶 400715；2. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室，浙江 湖州 313001

環(huán)境雄激素作為一類典型的內(nèi)分泌干擾物, 不僅會干擾生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)導(dǎo)致其生長發(fā)育受阻, 同時還會影響微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能[1-2], 并對人體健康和生態(tài)安全造成威脅． 環(huán)境中的雄激素主要來源于動物的分泌物和激素藥物的使用[1,3-4]． 研究發(fā)現(xiàn), 環(huán)境雄激素主要通過城市污水處理廠、 畜禽養(yǎng)殖場、 造紙廠及水產(chǎn)養(yǎng)殖場等廢水排放進入水環(huán)境, 可蓄積在水生生物體內(nèi), 并沿食物鏈進行傳遞, 進而對水域生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成危害[1,3-4]． 貝類作為水生食物網(wǎng)尤其是底棲食物網(wǎng)的重要組成部分之一, 對水域生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動具有重要的作用[5-6]; 同時, 貝類因口味鮮美、 營養(yǎng)價值高, 深受消費者的喜愛． 睪酮(Testosterone), 又稱睪丸素、 睪丸酮, 是生物體內(nèi)含量最高、 最重要的雄激素, 也是一種主要的環(huán)境雄激素[1]． 開發(fā)一種測定貝類組織中睪酮質(zhì)量濃度的前處理方法, 有助于貝類組織中類固醇激素的定量分析, 可為研究類固醇激素污染物在底棲食物網(wǎng)中的遷移轉(zhuǎn)化與貝類水產(chǎn)品安全監(jiān)管提供方法基礎(chǔ)與技術(shù)支撐．

前處理方法中樣品的提取與凈化對水產(chǎn)品中類固醇激素測定的回收率、 穩(wěn)定性等具有較大的影響． 陳秋華等[22]在篩查水產(chǎn)品16種激素殘留的研究中發(fā)現(xiàn), 提取劑和吸附劑的種類和使用量均會影響目標化合物的回收率． 通常用于提取動物組織中激素物質(zhì)的溶劑有乙酸乙酯、 甲醇、 正己烷、 叔丁基甲醚、 二氯甲烷、 乙腈、 乙醚等及其混合溶液[23-26], 但由于目標激素和基質(zhì)差異, 樣品前處理提取劑的選擇并無統(tǒng)一定論, 因此針對貝類中特定激素測定需進行提取劑的優(yōu)化篩選． 樣品經(jīng)過提取和富集后, 常采用液相萃取除脂法[27-29]、 固相萃取柱凈化法[24,30-31]、 凈化劑凈化法[17,22, 32]、 超低溫冷凍離心除脂法[19,33-34]等去除樣品基質(zhì)中的脂肪、 蛋白質(zhì)等雜質(zhì), 從而降低干擾, 提高方法的檢出限, 并延長儀器的使用壽命[23]． 黃鸞玉等[19]認為, 除脂是水產(chǎn)品前處理必不可少的步驟, 且除脂方法以及固相萃取柱的選擇都會影響凈化效果． 李佩佩等[35]在測定水產(chǎn)品中甲基睪酮的殘留時發(fā)現(xiàn), 石油醚作為除脂溶劑, 易殘留, 會對目標物造成嚴重干擾, 因此, 除脂凈化方法直接影響貝類中雄激素的回收率． 冷凍離心除脂法因操作簡便、 凈化效果好、 待測激素損失較低[18,36], 常單獨或與其他方法結(jié)合使用, 被廣泛應(yīng)用于各種基質(zhì)中激素物質(zhì)的凈化． 本研究擬在超低溫冷凍離心的基礎(chǔ)上, 結(jié)合凈化劑[37-38]和固相萃取柱[19], 探尋適用于貝類的高效率凈化方法．

水產(chǎn)品中類固醇激素的檢測研究對象多為魚類和甲殼類, 貝類中的類固醇激素測定的研究鮮見報道[17, 39], 因此, 本研究擬以典型雄激素睪酮作為目標化合物, 利用超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS), 對貝類-河蜆(Corbiculafluminea)樣品前處理方法中的提取和凈化等條件進行優(yōu)化, 以期得到較為理想的貝類雄激素測定前處理方法．

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

睪酮, 北京索萊寶科技有限公司; 睪酮-d3, SUPELCO公司, 純度均大于98.0%． 甲醇、 丙酮、 乙酸乙酯、 乙腈、 正己烷、 二氯甲烷, Honeywell公司; 甲酸, CNW公司; 叔丁基甲醚, Alfa Aesar公司, 以上有機試劑均為色譜純試劑． 中性氧化鋁(FCP100-200目), 上海瀘試實驗室器材股份有限公司; 無水硫酸鎂(99.95%), 無水硫酸鈉(99.95%), 上海麥克林生化科技有限公司, 均為分析純． N-丙基乙二胺(PSA), 杭州微米派科技有限公司; 高純氮氣, 重慶啟迪氣體有限公司; Poly-sery HLB(Hydrophilic and Lipophilic Balance)固相萃取柱, CNW公司．

1.2 標準曲線的配制

用乙腈將4.00 mg/L的睪酮標準儲備溶液逐級稀釋, 配制成0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 μg/mL的標準溶液, 混勻后測定, 以質(zhì)量濃度為橫坐標, 以色譜圖峰面積為縱坐標繪制標準曲線．

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的制備

實驗所用河蜆購自重慶市開州區(qū)某養(yǎng)殖場, 剖取軟體組織于離心管中, 組織搗碎機搗碎并充分勻漿, -20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3.2 睪酮的提取

一個黑社會組織，之所以能夠作惡近20年，得益于背后的“保護傘”——無為縣法院刑事審判庭原副庭長吳業(yè)平。據(jù)周幫海供述，吳業(yè)平有“能量”。七年前，周幫海的馬仔吳克任犯下兩起尋釁滋事、兩起故意傷害案件，他向吳業(yè)平送上2萬元并請求輕判。在“吳庭長”的操縱下，身負四起情節(jié)嚴重案件的吳克任，僅被判處緩刑二年。連吳業(yè)平自己都說：“像這樣的案子判緩刑，在法院還從來沒有過?！?/p>

目標提取物睪酮為弱極性化合物, 本研究分別選用乙酸乙酯、 乙腈、 叔丁基甲醚、 正己烷-二氯甲烷(1∶1)4種提取劑提取睪酮, 具體步驟如下:

準確稱取(1.00±0.02) g勻漿試樣于研缽中(3重樣), 加入5 g預(yù)烘(110 ℃, 12 h)后的無水硫酸鈉, 研磨至生物樣品不粘在研缽上, 靜置30 min后, 轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中, 并用5 mL提取劑潤洗研缽和研磨杵, 全部轉(zhuǎn)移至離心管中; 加入0.5 mL質(zhì)量濃度為1 μg/mL的睪酮-d3, 混勻; 向離心管中再次加入提取劑5 mL; 渦旋振蕩提取5 min后, 超聲10 min; 再次渦旋振蕩5 min后, 靜置提取1 h; 于4 ℃ 5 000 r/min離心10 min后將上清液轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中; 殘渣用5 mL提取劑重復(fù)提取2次, 合并上清液(共20 mL), 待凈化．

針對不同提取劑進行回收率比較分析時, 統(tǒng)一采用超低溫冷凍離心法凈化樣品．

1.3.3 凈化

超低溫冷凍離心: 將上清液于-80 ℃冷凍1 h; 解凍后, 于4 ℃ 10 000 r/min離心8 min; 準確移取5 mL上清液于玻璃試管中, 氮吹至近干, 取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)復(fù)溶后, 定容至1 mL; 過0.22 μm有機濾膜, UPLC-MS/MS測定．

超低溫冷凍離心-凈化劑: 將上清液于-80 ℃冷凍1 h; 解凍后, 于4 ℃ 10 000 r/min離心8 min; 準確移取10 mL上清液于已加入凈化劑(0.5 g無水硫酸鎂, 0.5 g中性氧化鋁和0.2 g PSA)的離心管中, 渦旋混勻5 min, 以10 000 r/min離心5 min后準確移取5 mL上清液于玻璃試管中, 氮吹至近干, 取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)復(fù)溶后, 定容至1 mL; 過0.22 μm有機濾膜, UPLC-MS/MS測定．

超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱: 預(yù)先用3 mL甲醇和3 mL水先后緩慢通過HLB固相萃取柱使其充分活化; 將上清液于-80 ℃冷凍1 h; 解凍后, 于4 ℃ 10 000 r/min離心8 min; 準確移取5 mL上清液于玻璃試管中, 氮氣吹干后加入3 mL甲醇溶解殘渣, 并將其轉(zhuǎn)至15 mL離心管中; 再用7 mL純水潤洗玻璃試管, 合并至離心管中, 混勻; 取甲醇溶液層以小于2 mL/min的流量通過預(yù)先活化的HLB固相萃取柱上樣, 棄去濾液; 再用6 mL的20%甲醇溶液通過HLB固相萃取柱進行淋洗, 棄去流出液, 抽吸HLB固相萃取柱至近干; 用4 mL的90%甲醇溶液對HLB固相萃取柱進行洗脫, 收集洗脫液; 將洗脫液在50 ℃下氮氣吹干后, 取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)充分復(fù)溶, 定容至1 mL; 過0.22 μm有機濾膜, UPLC-MS/MS測定．

1.4 UPLC-MS/MS條件

采用Waters UPLC-Q-TOF-MS ACQUITY UPLC系統(tǒng)在靈敏模式下用正電噴霧(ESI+)離子源對睪酮定量． 色譜柱為ACQUITY BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), 睪酮進樣體積為1 μL, 恒定流速為0.4 mL/min; 流動相由0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)組成; 去溶劑化溫度和離子源溫度分別為400 ℃和120 ℃, 錐形和去溶劑化的流速分別為50 L/h和800 L/h; 毛細管電壓和錐形電壓分別為3 000 V和40 V, MS碰撞能量范圍為20～40 eV(圖1)．

圖1 乙酸乙酯提取睪酮的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

1.5 數(shù)據(jù)處理

對實驗所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2019進行處理．

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

本研究考察了乙酸乙酯、 叔丁基甲醚、 正己烷-二氯甲烷(1∶1)、 乙腈4種提取劑對貝類-河蜆組織中睪酮的提取效果． 由表1可知, 乙酸乙酯作為提取劑回收率最高, 達101.6%, 叔丁基甲醚、 正己烷-二氯甲烷(1∶1)、 乙腈對睪酮的提取回收率相當(dāng), 在84.8%～89.4%之間． 4種提取劑中, 正己烷-二氯甲烷(1∶1)提取效率最低, 可能是正己烷提取油脂雜質(zhì)較多, 不利于凈化[40]． 使用乙腈作為提取劑時相對標準偏差為12.6%, 遠大于其他3種提取劑, 表明乙腈作為提取劑穩(wěn)定性不足, 可能是乙腈能致蛋白質(zhì)變性, 易使樣品結(jié)塊, 從而導(dǎo)致回收率不穩(wěn)定[41]． 綜上所述, 4種提取劑中, 乙酸乙酯作為提取劑回收率高且穩(wěn)定, 是河蜆組織中提取睪酮的最優(yōu)選擇．

表1 提取劑對睪酮回收率的影響

2.2 凈化方法的選擇

超低溫冷凍離心、 超低溫冷凍離心-凈化劑、 超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱3種凈化方法的凈化效果見表2． 結(jié)果表明, 提取方法相同的情況下, 超低溫冷凍離心法的回收率為89.4%, 高于超低溫冷凍離心-凈化劑法和超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱法． 超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱法回收率最低, 為77.4%, 原因可能是采用固相萃取柱進行萃取損失了部分目標化合物． 結(jié)果表明, 通過超低溫冷凍離心法凈化樣品, 凈化效果好、 回收率高、 操作簡便, 可作為河蜆組織中睪酮提取后的凈化方法．

表2 凈化方法對睪酮回收率的影響

2.3 線性范圍、 檢出限和定量限

在選定的色譜/質(zhì)譜條件下測定質(zhì)量濃度分別為0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 μg/mL的睪酮標準溶液系列, 結(jié)果表明, 睪酮質(zhì)量濃度在0.05～1.00 μg/mL內(nèi)與色譜峰面積呈線性正相關(guān), 其回歸方程為y=390 214x-12 033,R2=0.998 9．

根據(jù)信噪比S/N≥3作為檢出限,S/N≥10作為定量限, 計算得出河蜆組織中睪酮的檢出限和定量限分別為6.25 ng/g和20 ng/g．

2.4 回收率和精密度

針對空白基質(zhì)樣品, 加標回收實驗分別添加睪酮標準物質(zhì)為低水平(20 μg/kg)、 中水平(40 μg/kg)、 高水平(200 μg/kg), 進行3次平行實驗． 測定結(jié)果表明, 睪酮的平均回收率為66.4%～101.1%, 測定值的相對標準偏差在2.3%～11.6%之間(表3)． 隨著加標量的增加回收率不斷升高, 在國家標準GB/T 27404-2008規(guī)定的精密度范圍內(nèi), 方法的準確度和精密度均符合實際分析檢測的要求．

表3 河蜆中睪酮的加標回收率及精密度(n=3)

2.5 水產(chǎn)品中雄激素提取方法比較分析

因提取所用生物樣品多為組織勻漿液, 含水率高, 基質(zhì)水分殘留對提取凈化效果會產(chǎn)生較大影響[32]． 楊霄等[14]、 李凱華等[32]研究表明, 去除生物樣品中的水分有利于提高目標化合物的回收率． 提取前加入無水硫酸鈉[42-43]、 提取時加入無水硫酸鈉[32]或無水硫酸鎂[14]、 凈化前過無水硫酸鈉柱[8]等, 均可有效去除水分． 考慮操作簡便性及提取液體積的量化問題, 本研究中采用預(yù)烘后的無水硫酸鈉研磨勻漿后的樣品, 靜置至水分吸收完全后加入提取劑提取．

水產(chǎn)品中雄激素的提取常用的提取劑包括乙腈、 乙酸乙酯、 乙醚、 叔丁基甲醚、 甲醇、 正己烷、 乙腈-甲酸/乙酸混合液等[22, 24-25, 33]． 總體而言, 在超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品內(nèi)睪酮的前處理中, 乙酸乙酯作為提取劑的提取效果較好(表4)． 楊帆等[16]、 鄒紅梅等[17]、 李向軍等[24]研究均發(fā)現(xiàn), 魚類和甲殼類中睪酮的提取使用乙酸乙酯效果最佳, 回收率高、 穩(wěn)定性好, 優(yōu)于乙腈、 正己烷、 甲醇等, 與本文關(guān)于貝類中睪酮的提取研究結(jié)果一致． 此外, 鄒紅梅等[17]、 李向軍等[24]研究還發(fā)現(xiàn), 同時提取草魚中甲基睪酮等多種激素時, 乙酸乙酯對大部分目標化合物的提取效率高于甲醇和乙腈． 關(guān)于黃鱔、 明蝦等水產(chǎn)品中甲基睪酮、 群勃龍、 司坦唑醇等雄激素的提取研究亦表明, 乙酸乙酯作為提取劑的提取效率高, 且具有不易揮發(fā)、 毒性較小等優(yōu)勢[16, 27, 34,44]． 而陳秋華等[22]研究發(fā)現(xiàn)1%乙酸-乙腈作為提取劑提取大黃魚、 南美白對蝦、 梭子蟹中的雄激素時, 提取效果優(yōu)于乙腈、 乙酸乙酯、 丙酮． 李凱華等[32]采用1%乙酸-乙腈提取草魚中的雄激素, 能有效提取目標物． 綜上, 乙酸乙酯和1%乙酸-乙腈對水生生物體中雄激素提取效果均較好, 但雄激素的回收率還與提取對象、 雄激素種類、 提取方法和凈化方法等相關(guān)．

表4 水產(chǎn)品中睪酮檢測的前處理方法比較

提取過程中, 可采取渦旋、 振蕩、 超聲等方法輔助提升提取效果[25]． 本文在對睪酮進行提取時采用渦旋振蕩-超聲-渦旋振蕩的方式, 一方面超聲能增加提取劑的穿透力從而進入細胞內(nèi)部[23], 提取率高、 操作簡便且樣品處理量多[8]; 另一方面, 振蕩可以加速被提取成分的擴散、 釋放[25], 使得提取更加充分． 提取過程中, 重復(fù)提取可提高樣品的回收率, 以重復(fù)1～2次為宜[17, 45-46]．

2.6 水產(chǎn)品中雄激素樣品凈化方法比較分析

樣品凈化方法中, 液相萃取除脂法, 常采用正己烷、 石油醚作為萃取劑． 然而黃鸞玉等[19]發(fā)現(xiàn)正己烷去脂的同時可一定程度溶解睪酮等類固醇激素, 故不可避免會造成目標化合物的損失, 且由于液相萃取過程中易發(fā)生乳化, 采用此法凈化樣品的回收率和精密度均不夠理想[18, 28]．

固相萃取柱凈化中常采用十八烷基鍵合硅膠吸附(C18)柱和HLB柱對水產(chǎn)品中的類固醇激素進行純化． 已有研究表明, HLB固相萃取柱基質(zhì)可耐受不同的溶劑, 使用時回收率不受柱床干涸的影響, 且吸附劑表面積較C18柱大, 除雜效果更好[19]． 靳鳳龍[47]在研究動物源性食品中性激素的測定方法時發(fā)現(xiàn), HLB固相萃取柱對性激素的回收率達89.7%～96.6%, 是C18柱的1.2倍． 李向軍等[24]發(fā)現(xiàn), 采用HLB固相萃取柱凈化樣品時, 可獲得較高的回收率, 然而, 當(dāng)處理對象為大黃魚等高油脂樣品時, 易發(fā)生乳化, 導(dǎo)致固相萃取柱堵塞． 本研究亦發(fā)現(xiàn), 河蜆組織經(jīng)提取后, 以超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱作為凈化方法時的樣品回收率低于其他方法, 表明凈化過程中目標化合物有損失．

凈化劑凈化樣品時, 常用的凈化劑包括PSA、 中性氧化鋁、 無水硫酸鎂、 NaCl等． PSA作為吸附劑能清除許多基質(zhì)成分, 但范小龍等[37]研究發(fā)現(xiàn)僅加入PSA, 目標激素的回收率未明顯提高, 因此可加入其他凈化劑共同凈化樣品． 無水硫酸鎂在凈化過程中可吸取多余的水分[37], 中性氧化鋁具有良好的除脂能力[38], 二者與PSA共同凈化樣品可提高凈化效果． 任雪冬等[38]在測定土壤中激素藥物殘留時發(fā)現(xiàn)以PSA、 中性氧化鋁及無水硫酸鎂為凈化劑組合的樣品基質(zhì)干擾最小, 回收率最高．

超低溫冷凍離心除脂法操作簡便、 凈化效果好、 待測激素損失較低[18], 已被廣泛應(yīng)用于各種基質(zhì)中類固醇激素的凈化． 孟霞等[34]研究發(fā)現(xiàn), 黃鱔甲基睪酮的提取與凈化中采用低溫冷凍離心除脂, 樣品回收率達88.1%～105.5%． 低溫冷凍離心法常結(jié)合其他凈化法對提取樣品進行純化． 黃鸞玉等[19]將冷凍離心結(jié)合HLB固相萃取柱凈化羅非魚樣品, 甲基睪酮的回收率為73.6%～91.4%． 本研究中, 超低溫冷凍離心凈化后, 回收率最高, 高于超低溫冷凍離心-凈化劑和超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱, 表明超低溫冷凍離心凈化效果好, 超低溫冷凍后的凈化劑凈化和HLB固相萃取反而導(dǎo)致樣品存在一定程度的損失． 田良良等[33]在測定魚蝦中丙酸睪酮殘留量時亦發(fā)現(xiàn), 僅采用超低溫冷凍離心法凈化樣品, 丙酸睪酮的回收率為71.2%～104.5%, 而超低溫冷凍離心與固相萃取柱相結(jié)合的方法并沒有使雜峰減少, 與本研究結(jié)果相一致． 使用超低溫冷凍離心法凈化樣品, 簡化了前處理步驟, 簡便易操作．

2.7 貝類中有機物的提取與凈化

水產(chǎn)品中類固醇激素的檢測研究對象多為魚類和甲殼類, 貝類中雄激素測定的研究鮮見報道[17,39]． 不同于魚、 蝦中激素的檢測主要針對肌肉中的激素, 貝類中激素檢測多針對所有軟體組織, 基質(zhì)較復(fù)雜． 已有研究表明, 貝類組織中目標化合物提取的回收率變化范圍大． 貝類中關(guān)于多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon, PAHs)、 多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)等檢測相關(guān)文獻顯示, 貝類空白基質(zhì)加標回收率差異均較大[43,48-52]． 曹方方等[42]研究亦表明, 花蛤中的有機氯農(nóng)藥p, p’-二氯二苯二氯甲烷(p, p’-dichlorodiphenyl dichloroethane, p, p’-DDD)的回收率為62.3%～106.0%, 相對標準偏差為5.6%～21.0%, o, p’-二氯二苯三氯甲烷(o, p’-dichlorodiphenyl trichloroethane, o, p’-DDT)的回收率為73.8%～118.0%, 相對標準偏差為4.6%～16.0%．

本文采用乙酸乙酯作為提取劑, 超低溫冷凍離心作為凈化方法提取河蜆中的睪酮, 回收率為101.6%, 而空白基質(zhì)加標回收率為66.4%～101.1%, 相對標準偏差為2.3%～11.6%, 變化范圍略大, 我們推測可能貝類軟體組織樣品基質(zhì)較復(fù)雜, 自身造成的影響難以避免．

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了河蜆組織中睪酮質(zhì)量濃度測定的前處理方法: 選取乙酸乙酯作為提取劑, 渦旋振蕩超聲提取, 并經(jīng)超低溫冷凍離心凈化后利用超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)進行定量分析． 該方法簡便、 快速, 且具有較高的準確度和精密度, 在20～200 μg/kg加標水平范圍內(nèi), 回收率為66.4%～101.1%, 相對標準偏差為2.3%～11.6%, 適用于河蜆組織中睪酮的提取測定, 也可為其他動物組織中的環(huán)境雄激素殘留分析提供參考．