趙 宇,鄧夢(mèng)青,盧昱希,唐遠(yuǎn)江,張 濤,陶小艷,李 婷,張曉可,文正常,潘 永,王 璇

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所,貴州 貴陽(yáng) 550005)

0 引言

【研究意義】沙門(mén)氏菌(Salmonella)是一種人獸共患病原菌,是肉鴿養(yǎng)殖業(yè)中流行面和傳染性最廣、危害性極大的常見(jiàn)流行性傳染病[1],加之目前病原菌耐藥性的提升,尋求有效防治沙門(mén)氏菌病的抗生素替代品迫在眉睫。【前人研究進(jìn)展】沙門(mén)氏菌主要傳播途徑為糞-口途徑以及通過(guò)食入被污染飼料和水源傳播,也可通過(guò)胚胎使種蛋受感染進(jìn)而傳遞給后代。此病原易侵染1月齡內(nèi)幼鴿[2],被感染肉鴿表現(xiàn)多為急性下痢,糞便呈石灰漿樣白色稀薄或呈青綠色,并發(fā)出惡臭,部分病例可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)變形腫大以及神經(jīng)癥狀等[3]。成年鴿感染后食欲減退、精神沉郁、機(jī)體消瘦,其產(chǎn)蛋量、孵化率等生產(chǎn)性能嚴(yán)重下降,給肉鴿養(yǎng)殖業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。臨床致病性沙門(mén)氏菌易產(chǎn)生耐藥性且不易控制,在養(yǎng)殖過(guò)程中由于抗生素的反復(fù)不合理使用導(dǎo)致病原菌耐藥性快速提升,抗生素濫用也易造成禽類產(chǎn)品的藥物殘留,不僅增加了該病的防治壓力,也給人類健康帶來(lái)威脅[6-8]。中草藥具備作為減抗替抗產(chǎn)品的天然優(yōu)勢(shì),不但具有廣譜的抑菌作用、降低細(xì)菌耐藥性形成,同時(shí)還有促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、提高免疫等功能,是耐藥病原菌防控的新途徑[9]。【研究切入點(diǎn)】目前,中草藥對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制作用研究較普遍,其中,對(duì)豬源沙門(mén)氏菌與雞源沙門(mén)氏菌的研究較為集中,而在鴿沙門(mén)氏菌的研究相對(duì)較少。【擬解決關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)分離鑒定臨床鴿源沙門(mén)氏菌,探討分離菌對(duì)常見(jiàn)抗生素及自擬復(fù)方中藥的敏感性,以期為肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)沙門(mén)氏菌合理用藥及中獸藥防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采于西南地區(qū)某肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)10日齡發(fā)病乳鴿病死后腸內(nèi)容物及糞便。沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院生理生化實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 主要藥品與試劑 抗菌藥物藥敏紙片、細(xì)菌生化鑒定管、革蘭氏染色液及各類細(xì)菌培養(yǎng)基均購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司;黃連、黃芩、黃柏、苦參、木香、白頭翁、訶子、澤瀉、升麻、柴胡、黃柏、蒲公英、金銀花、烏梅、藿香等均購(gòu)自萬(wàn)和藥房;細(xì)菌基因組DNA抽取試劑盒購(gòu)自生工生物工程股份有限公司;膠回收試劑盒購(gòu)自索萊寶科技有限公司;2×Taq PCR MasterMix、2000 DNA Ladder購(gòu)自擎科生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 PCR儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司,離心機(jī)購(gòu)自Beckman公司,超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司,瓊脂凝膠電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 鴿源沙門(mén)氏菌的分離培養(yǎng) 將采集的腸內(nèi)容物及糞便分別無(wú)菌操作接種于LB肉湯中37℃振蕩培養(yǎng)24 h,再分別接種于麥康凱培養(yǎng)基和SS培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h后,根據(jù)目標(biāo)菌理論形態(tài)特征挑選單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)后置于4℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)菌鑒定

1) 細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定。取純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察。

2) 細(xì)菌生化鑒定。將分離菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于麥芽糖、枸櫞酸鹽、吲哚、蛋白胨水、葡萄糖、乳糖、尿素、甘露醇、氯化鉀、H2S等微量生化管,置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后,觀察結(jié)果。

3) 16SrRNA基因的擴(kuò)增及測(cè)序。按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行DNA提取,以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列為F,5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGA-3′;R,5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC-3′。

PCR反應(yīng)體系50 μL：ddH2O 25 μL,2×PCRmix 20 μL,基因組DNA模板4 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸80 s,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,產(chǎn)物使用膠回收試劑盒回收純化后送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST檢索系統(tǒng),利用DNA star進(jìn)行同源性分析,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 自擬中藥復(fù)方藥液制備 自擬5個(gè)中藥復(fù)方,方一由黃連、金銀花、木香、藿香等中藥組成,方二由白頭翁、黃柏、黃芩、蒲公英、烏梅等中藥組成,方三由連翹、蒲公英、夏枯草等中藥組成,方四由白頭翁、魚(yú)腥草、金銀花、烏梅、訶子、白術(shù)等中藥組成,方五由黃芩、秦皮、訶子、柴胡等10味中藥組成。采用傳統(tǒng)水煎法制備中藥組方制劑[10],各方按比例配好使用水煎法使每方藥液含生藥1 g/mL,分裝于離心管內(nèi)3 000 r/min,離心30 min,取上清液裝于西林瓶,121℃滅菌20 min,4℃避光保存。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

1) 抗生素敏感性試驗(yàn)。采用紙片法,吸取20 μL純培養(yǎng)后的菌液均勻涂抹在培養(yǎng)基上,放置藥敏紙片,37℃恒溫培養(yǎng)24 h后,觀察、測(cè)量抑菌圈的直徑,按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)藥酶紙片規(guī)則標(biāo)準(zhǔn)判定。

2) 中藥復(fù)方的敏感性試驗(yàn)。采用牛津杯法,吸取上述菌液20 μL均勻涂抹在培養(yǎng)基上,放置于無(wú)菌牛津杯,加入中藥復(fù)方液200 μL(1 g/mL),每個(gè)復(fù)方做平行對(duì)照,37℃培養(yǎng)24 h后,觀察、測(cè)定抑菌圈的直徑(mm)。敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑≥20 mm為極敏感;15 mm≤抑菌直徑<20 mm為高敏;10 mm≤抑菌直徑<15 mm為中敏;抑菌直徑<10 mm為低敏或無(wú)效。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初步鑒定

通過(guò)麥康凱、SS培養(yǎng)基培養(yǎng)及革蘭氏染色,分離菌呈直徑1～2 mm表面光滑、邊緣齊整的圓形菌落。經(jīng)鏡檢觀察,菌體呈小短桿菌形態(tài),革蘭氏染色陰性,特性與沙門(mén)氏菌相符合(圖1～2),初步判定分離菌株為沙門(mén)氏菌。

圖 1 分離菌在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the isolated strain on medium

圖 2 分離菌革蘭氏染色形態(tài)(10×100)Fig.2 Gram staining morphology of the isolated strain (10×100)

2.2 菌株的生化鑒定

由表1可見(jiàn),分離株與沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株生化鑒定結(jié)果相一致,進(jìn)一步驗(yàn)證分離菌株為沙門(mén)氏菌。

表1 菌株的微量生化鑒定Table 1 Microbiochemical identification of the isolated strain

2.3 16SrRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果菌株的分子鑒定

PCR擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳后,獲得大小約為1 500 bp條帶,與預(yù)期片段(1481bp)大小相符(圖3)。同源性分析顯示(圖4～5),分離菌16SrRNA序列與6-996 Salmonella entericasubsp的同源性為99.2%,說(shuō)明該分離菌為沙門(mén)氏菌。

注：M,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL 2 000);1,分離菌擴(kuò)增條帶。Note：M,DNA marker (DL 2 000);1,amplification band of the isolated strain圖 3 菌株16SrRNA PCR擴(kuò)增圖譜Fig.3 PCR amplification chromatogram of 16SrDNA strain

圖 4 分離菌株的同源性Fig.4 Homology analysis of the isolated strain

圖 5 分離株基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of the isolated strain

2.4 菌株的抗藥性

2.4.1 抗生素藥酶紙片試驗(yàn) 由表2可見(jiàn),分離菌對(duì)恩諾沙星等4種喹諾酮類藥物、慶大霉素、大觀霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢哌酮敏感,對(duì)阿莫西林、克林霉素、新霉素呈中度敏感,對(duì)其他試驗(yàn)藥物表現(xiàn)為耐藥。

表2 分離菌藥敏紙片試驗(yàn)Table 2 Drug-sensitive paper test of the isolated strain

2.4.2 自擬中藥復(fù)方敏感試驗(yàn) 從抑菌圈結(jié)果判定(表3)：方四對(duì)分離菌呈高敏,方二、方三、方五對(duì)分離菌為中敏,方一對(duì)分離菌為低敏。

表3 自擬中藥復(fù)方對(duì)分離菌的體外抑菌效果Table 3 In vitro antibacterial effect of self-desined compound traditional Chinese medicine against the isolated strain

3 討論

在世界范圍內(nèi),沙門(mén)氏菌是危害較嚴(yán)重的食物源性病原菌之一,有30%甚至更高食物源性細(xì)菌污染由其引發(fā),做好該菌的防控對(duì)公共衛(wèi)生極其重要[11]。肉鴿主要感染鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌缺乏菌體抗原5的哥本哈根變種[3],該變種有通過(guò)食物鏈傳播給人類的風(fēng)險(xiǎn)[12]。隨著近年國(guó)內(nèi)肉鴿養(yǎng)殖業(yè)興起,肉鴿沙門(mén)氏菌病危害程度日益凸顯,梁德媚等[13]對(duì)上海農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)肉鴿群體調(diào)查發(fā)現(xiàn),沙門(mén)氏菌分離率為26.1%;在廣東、北京等地區(qū)近年也均從鴿病樣中檢測(cè)到沙門(mén)氏菌[14-15]。在此形勢(shì)下,養(yǎng)殖場(chǎng)常用抗生素治療鴿沙門(mén)氏菌病,耐藥問(wèn)題越發(fā)突出,病原菌對(duì)所用抗生素的耐藥性逐漸加強(qiáng),使抗生素的治療效果降低,療程延長(zhǎng),影響其預(yù)防和治療效果[16];除此之外,抗生素的大量使用導(dǎo)致產(chǎn)品中藥物殘留超標(biāo)[17],通過(guò)食品危害人類健康,或影響產(chǎn)品出口貿(mào)易,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[18]。因此,探尋高效、安全的抗生素替代品,是當(dāng)前疾病防控研究的熱點(diǎn)之一。

中藥在養(yǎng)殖業(yè)中具有極大的應(yīng)用潛力,中藥具有多種抑菌活性,耐藥性低,同時(shí)兼具資源豐富、毒副作用小等特點(diǎn)[19]。目前,研究人員發(fā)現(xiàn)五倍子、石榴皮、黃芩、天葵、金銀花等多味單藥及中藥組方制劑對(duì)畜禽沙門(mén)氏菌具有良好的抑制作[20-25]。分離沙門(mén)氏菌株顯示耐藥表型多樣性,提示了抗生素科學(xué)、合理使用緊迫性;同時(shí)針對(duì)該分離菌篩選到敏感中藥復(fù)方,為臨床治療鴿沙門(mén)氏菌用藥提供依據(jù),但臨床效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)的特性、革蘭氏染色觀察、PCR擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果判定試驗(yàn)分離的菌株為沙門(mén)氏菌,分離菌對(duì)恩諾沙星等4種喹諾酮類藥物、慶大霉素、大觀霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢哌酮敏感,對(duì)阿莫西林、新霉素、克林霉素呈中度敏感,對(duì)其他試驗(yàn)藥表現(xiàn)為耐藥;同時(shí)展開(kāi)自擬中藥復(fù)方對(duì)沙門(mén)氏菌的體外抑菌試驗(yàn),判定方四(白頭翁、魚(yú)腥草、金銀花、烏梅、訶子、白術(shù)等中藥)對(duì)分離菌呈高敏,方二(白頭翁、黃柏、黃芩、蒲公英、烏梅等中藥)、方三(連翹、蒲公英、夏枯草等中藥)、方五(黃芩、秦皮、訶子、柴胡等10味中藥)對(duì)分離菌為中敏,方一(黃連、金銀花、木香、藿香等中藥)對(duì)分離菌為低敏。