李藝池 梁金昌 韋承建 王東坤 王衛(wèi)民 陳勇華 宋光龍 胡希好 程德杰 任廣偉 王曉強(qiáng)

摘? 要：暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）LZ88是一株對多種病原真菌具有較強(qiáng)拮抗能力的生防細(xì)菌，產(chǎn)生的兩種揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）2-甲基丁酸和3-甲基丁酸對鏈格孢菌具有顯著的抑制作用。為進(jìn)一步研究其拮抗機(jī)制，本研究通過2-甲基丁酸和3-甲基丁酸混合物與鏈格孢菌的平板對扣試驗(yàn)觀察其拮抗作用，采用RNA-Seq技術(shù)對揮發(fā)性混合物拮抗下鏈格孢菌的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究，并對部分差異表達(dá)顯著的基因進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，2種揮發(fā)性有機(jī)化合物混合處理能顯著抑制鏈格孢菌的生長，菌絲表現(xiàn)出皺縮、塌陷的現(xiàn)象；通過差異表達(dá)分析共獲得3461個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中1714個(gè)上調(diào)表達(dá)，1747個(gè)下調(diào)表達(dá)。對獲得的DEGs進(jìn)行功能注釋及富集分析發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性有機(jī)化合物主要是通過影響鏈格孢菌的甘油磷脂代謝、MAPK信號通路以及聚酮類化合物的合成來抑制鏈格孢菌的生長發(fā)育。本研究揭示了2種揮發(fā)性化合物對鏈格孢菌的抑菌機(jī)制，為生防菌代謝產(chǎn)物的拮抗機(jī)制分析提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：暹羅芽孢桿菌；鏈格孢菌；揮發(fā)性有機(jī)化合物；轉(zhuǎn)錄組分析

中圖分類號：S435.72? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1007-5119（2023）02-0027-08

Abstract： Bacillus siamensis LZ88 is a biocontrol bacterium with strong antagonistic ability against a variety of pathogenic fungi. Previous study indicated that volatile organic compounds （VOCs）， 2-methylbutyric acid and 3-methylbutyric acid， produced by B. siamensis LZ88 showed significant inhibitory effects on Alternaria alternata. In the present study， the mechanism of 2-methylbutyric acid and 3-methylbutyric acid on A. alternate were further explored. Additionally， RNA-Seq was used to study the transcriptome of two volatile mixtures on A. alternata， and some significantly differentially expressed genes were verified by qRT-PCR. The results showed that the mixed treatment of the two VOCs could significantly inhibit the growth of A. alternata， and the hyphae were shrinkage and collapse. Through differential expression analysis， a total of 3461 differentially expressed genes （DEGs） were obtained， of which 1714 genes were up-regulated and 1747 genes were down-regulated. Functional annotation and enrichment analysis of the obtained DEGs revealed that various biological functions of A. alternata were affected by VOCs， including glycerophospholipid metabolism， MAPK signaling pathway and the synthesis of polyketides. The results give new insight into the inhibition mechanism of biocontrol bacteria metabolites products to A. alternata.

Keywords： Bacillus siamensis; Alternaria alternata; volatile organic compounds; transcriptome analysis

煙草赤星病是在煙葉成熟后期由半知菌亞門鏈格孢屬真菌（Alternaria spp.）引起的一種重要的葉部真菌性病害，具有潛育期短、流行速度快等特點(diǎn)[1]，是我國煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一，直接影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，煙草生產(chǎn)上對赤星病的防治主要以化學(xué)防治為主，但是長期大量使用化學(xué)藥劑會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，并造成煙葉農(nóng)藥殘留問題，影響煙葉品質(zhì)[2-3]。生物防治能有效避免或減少對生物和環(huán)境造成的不利影響，在煙草病蟲害的防控中具有極大的應(yīng)用前景。

芽孢桿菌是一種常見的生防細(xì)菌，并被廣泛應(yīng)用于植物病害的防控。芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括非揮發(fā)性化合物和揮發(fā)性化合物。其中，揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）主要包括酯類、烷烴類、醇類、萜類等[4]，可以抑制病原菌的生長，或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[5-6]。目前，利用芽孢桿菌揮發(fā)性化合物抑菌病原菌的研究主要以描述病原菌的菌絲、孢子變化和細(xì)胞形態(tài)為主。例如，特基拉芽孢桿菌XK29產(chǎn)生的揮發(fā)物2-甲基丁酸顯著抑制甘薯長喙殼菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，降低其產(chǎn)孢能力，導(dǎo)致菌絲折疊彎曲并形成不連續(xù)的空腔等[7]，但鮮有關(guān)于揮發(fā)性化合物抑制病原真菌生長的分子機(jī)制的報(bào)道。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）LZ88對多種病原真菌都具有顯著的拮抗活性，通過對其揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)2-甲基丁酸和3-甲基丁酸具有抗真菌活性，能夠抑制鏈格孢菌的生長[8]，但其拮抗機(jī)制尚不清楚。因此，本研究對2-甲基丁酸和3-甲基丁酸處理后的鏈格孢菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，探究兩種揮發(fā)性化合物對鏈格孢菌的抑菌機(jī)制，以期為利用暹羅芽孢桿菌揮發(fā)性化合物防控鏈格孢菌提供理論依據(jù)，并為相關(guān)病害的防控提供新思路。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試病原菌：鏈格孢菌（A. alternata）由本實(shí)驗(yàn)室從煙草赤星病發(fā)病煙葉上分離鑒定并保存。將鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）購自海博生物技術(shù)有限公司。

供試試劑：2-甲基丁酸（純度：98%；CAS：116-53-0）和3-甲基丁酸（純度≥99.0%；CAS：503-74-2）購自北京索萊寶生物科技有限公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；Yeasen Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）購自翌圣生物科技有限公司；SparkJade 2×SYBR Green qPCR Mix（With ROX）購自思科捷生物技術(shù)有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 2-甲基丁酸和3-甲基丁酸混合物對鏈格孢菌生長的影響? 根據(jù)前期的試驗(yàn)結(jié)果[8]，提前將2-甲基丁酸和3-甲基丁酸純品用無水乙醇分別配置成83.10和104.19 mg/mL的溶液。處理組分別吸取10 μL配置好的2-甲基丁酸和3-甲基丁酸溶液添加至直徑6 mm的濾紙片上，放在上層PDA培養(yǎng)基中心，取直徑約5 mm的新鮮鏈格孢菌菌餅接種在下層PDA培養(yǎng)基中心，將兩個(gè)培養(yǎng)皿對扣培養(yǎng)。對照組只在下層PDA培養(yǎng)基中心接種鏈格孢菌菌餅。處理組和對照組各重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)7 d后，測定抑菌效果。收集各組菌絲體，用掃描電子顯微鏡（SEM）拍照觀察不同處理組菌絲形態(tài)。

1.2.2? 轉(zhuǎn)錄組樣品準(zhǔn)備? 在150 mL無菌PDB液體培養(yǎng)基中接入4個(gè)鏈格孢菌菌餅，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)2 d后，處理組加入2-甲基丁酸（終濃度0.066 mg/mL）和3-甲基丁酸（終濃度0.058 mg/mL）各15 μL，對照組不做任何處理。對照組和處理組各3個(gè)重復(fù)，180 r/min、28 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 d，用無菌濾膜過濾出菌絲，再用無菌水清洗3次，抽濾去掉水分后用液氮速凍，置于–80 ℃保存，用于提取鏈格孢菌的總RNA。

1.2.3? RNA提取與測序文庫構(gòu)建? 鏈格孢菌總RNA的提取使用Trizol法。分別提取處理組和對照組的RNA，并通過Nanodrop 2000檢測總RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，Agilent 2100測定RIN值。將總RNA送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序（Illumina HiSeq 2500測序平臺）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)上傳至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫，登錄號為PRJNA900390。

1.2.4? 測序數(shù)據(jù)處理? 對過濾得到的高質(zhì)量clean reads進(jìn)行拼接組裝，獲得unigenes庫。通過Blast將篩選到的unigene序列與NR、Swiss-prot、Pfam、GO、COG和KEGG等公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得注釋信息。利用FPKM（Fragments Per Kilobases per

Millionreads）公式計(jì)算unigene的表達(dá)量，DESeq2軟件篩選差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs），以差異倍數(shù)[|log2（Fold change）|]>1和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate， FDR）＜0.05作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)。通過Goatools和KOBAS對篩選出的差異表達(dá)基因分別進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析。

1.2.5? qRT-PCR驗(yàn)證? 將鏈格孢菌的總RNA利用Yeasen HifairⅢ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，選取8 個(gè)與鏈格孢菌生長有關(guān)的DEGs進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。引物序列見表1，反應(yīng)體系參考SparkJade 2×SYBR Green qPCR Mix（With ROX）試劑盒，利用ABI SetpOne? Real-Time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體程序如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果根據(jù)2?ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2? 結(jié)? 果

2.1? 2-甲基丁酸和3-甲基丁酸混合物對鏈格孢菌生長的影響

如圖1所示，通過SEM觀察到對照組菌絲茂密，粗細(xì)較均勻，表面光滑，處理組的菌絲體損傷嚴(yán)重，菌絲粗細(xì)不均勻，出現(xiàn)明顯的皺縮、扭曲等現(xiàn)象。此外，與對照組相比，處理組樣品中孢子變形和塌陷，未附著分生孢子的菌絲出現(xiàn)破裂、收縮和扭曲，表明2-甲基丁酸和3-甲基丁酸的混合物抑制了鏈格孢菌絲的生長。

2.2? 測序結(jié)果的評估

根據(jù)VOCs對鏈格孢菌生長的影響效果，選取對照組和處理組各3個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。如表2所示，獲得的raw reads序列數(shù)量在23 477 010～55 234 710之間，過濾掉低質(zhì)量的序列reads后，獲得的clean reads序列的數(shù)量在23 476 806～55 234 282之間；滿足Q30標(biāo)準(zhǔn)的堿基數(shù)均達(dá)到95%以上，堿基錯(cuò)誤率均值約為0.0232%，表明測序質(zhì)量良好，可以為后續(xù)的分析提供可靠的原始數(shù)據(jù)。根據(jù)PCA分析結(jié)果（圖2），PC1解釋78.13%的變量，對照組和處理組分別聚成一簇，對照組和處理組間具有明顯差異。

2.3? 基因表達(dá)差異

與對照組相比，經(jīng)VOCs處理后的鏈格孢菌中有3461個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中上調(diào)表達(dá)的基因有1714個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有1747個(gè)（圖3）。對差異表達(dá)基因進(jìn)行COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）注釋，共有3255個(gè)DEGs注釋到COG數(shù)據(jù)庫，包含1635個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，1620個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。在上調(diào)表達(dá)基因中翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成（J），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊、分子伴侶（O），氨基酸運(yùn)輸與代謝（E），細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌與囊泡運(yùn)輸（U）這4類最多，占到78.72%；而細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌與囊泡運(yùn)輸（U），碳水化合物運(yùn)輸與代謝（G），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊、分子伴侶（O）以及轉(zhuǎn)錄（K）這4類在下調(diào)基因中所占比例較高，達(dá)到85.31%（圖4）。

2.4? 富集分析

2.4.1? 差異表達(dá)基因GO功能富集分析? 對下調(diào)的DEGs進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)（圖5），細(xì)胞組分中細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、膜組成部分和膜固有成分富集基因數(shù)較多，而生物過程中脂質(zhì)代謝過程富集最顯著。對上調(diào)的DEGs進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞氨基酸生物合成過程、核糖核蛋白復(fù)合體組裝和有機(jī)酸分解代謝過程3個(gè)功能最顯著富集。

2.4.2? 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析? 對1714個(gè)上調(diào)和1747個(gè)下調(diào)的DEGs分別進(jìn)行KEGG富集分析（圖6-7），發(fā)現(xiàn)有937個(gè)上調(diào)的DEGs定位到112條KEGG通路中。顯著富集的通路有核糖體，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)，其中富集基因數(shù)目最多的是核糖體通路。另外有391個(gè)下調(diào)的DEGs定位到97條KEGG通路中，顯著富集的有甘油磷脂代謝、醚脂代謝、MAPK信號通路，富集基因數(shù)目最多的是甘油磷脂代謝通路。

2.5? 與鏈格孢菌生長相關(guān)代謝通路的差異表達(dá)基因分析

結(jié)合COG功能注釋、GO富集以及KEGG富集，從所有的差異表達(dá)基因中篩選出與鏈格孢菌生長相關(guān)的差異表達(dá)基因（p<0.01），下調(diào)的基因主要參與甘油磷脂代謝、MAPK信號通路及聚酮類物質(zhì)的合成，上調(diào)的基因主要參與谷胱甘肽代謝、淀粉和蔗糖代謝等過程（表3）。

2.6? qRT-PCR驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，從篩選出的差異表達(dá)基因中隨機(jī)挑選8個(gè)差異顯著的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，其中包括5個(gè)下調(diào)表達(dá)基因和3個(gè)上調(diào)表達(dá)基因。結(jié)果表明，所選基因的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果趨勢一致（圖8），說明轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果是可靠的。

3? 討? 論

微生物在其生長代謝過程中會產(chǎn)生多種非揮發(fā)性和揮發(fā)性次級代謝產(chǎn)物[9]。在自然環(huán)境狀態(tài)下，揮發(fā)性有機(jī)化合物是以多種化合物混合的形式產(chǎn)生。因此，本研究通過模擬自然環(huán)境狀態(tài)，將暹羅芽孢桿菌LZ88[8]產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物2-甲基丁酸和3-甲基丁酸混合后處理鏈格孢菌，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步分析了2-甲基丁酸和3-甲基丁酸混合物對鏈格孢菌的抑制作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)VOCs通過調(diào)控鏈格孢菌的甘油磷脂代謝途徑、MAPK信號通路以及聚酮類物質(zhì)的合成等抑制菌絲的生長繁殖。

甘油磷脂是真核生物中生物膜的重要組成部分，參與細(xì)胞膜對蛋白質(zhì)的識別和信號傳導(dǎo)，與菌絲生長發(fā)育密切相關(guān)。線粒體膜由磷脂雙分子層組成，參與調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)及線粒體功能發(fā)揮的過程[10]，為生命提供能量[11]。在本研究中甘油磷脂代謝途徑中編碼磷脂酰絲氨酸合酶（AFT_927247）、磷脂酰絲氨酸脫羧酶（AFT_189401）、磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（AFT_789367）、FabD/溶血磷脂酶類蛋白（AFT_1009916）、溶血磷脂酶類蛋白（AFT_1061421）的基因顯著下調(diào)，線粒體內(nèi)外膜的磷脂生物合成受阻。研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母中，PE（磷脂酰乙醇胺）和PS（磷脂酰絲氨酸）的生物合成喪失會導(dǎo)致線粒體缺陷，從而使小突變體的形成增加[12]；白色念珠菌磷脂酰絲氨酸（PS）合酶突變體cho1Δ/Δ缺乏PS，磷脂酰乙醇胺降低，在一定程度上影響了線粒體呼吸功能，突變體表現(xiàn)出絲狀生長缺陷[13]。因此，本研究中VOCs可能通過抑制磷脂的合成，使線粒體內(nèi)外膜不能行使正常的功能，進(jìn)而影響鏈格孢菌菌絲的正常生長。

MAPK信號通路是調(diào)控許多病原真菌生長、發(fā)育和致病性胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑[14]。在本研究中MAPK信號通路中細(xì)胞壁完整性途徑（cell wall intergrity， CWI）的基因Bck1（AFT_927542）和Fks2（AFT_1005247）顯著下調(diào)，表明VOCs處理干擾了鏈格孢菌細(xì)胞壁完整性途徑中的級聯(lián)組分，阻礙了細(xì)胞壁的合成，對菌絲細(xì)胞壁完整性造成影響。此外，MAPK信號通路中高滲透壓途徑（High osmolarity pathway，HOG）相關(guān)的Sln1（AFT_946700）、Ssk1（AFT_186722）和Sko1顯著下調(diào)，表明VOCs處理影響菌絲對外界壓力做出適應(yīng)性反應(yīng)。這與張楠等[15]在膠孢炭疽菌中發(fā)現(xiàn)的HOG途徑上游感受器Sho1同源基因CgSho1缺失，造成突變菌株?duì)I養(yǎng)生長緩慢、產(chǎn)孢量下降、菌絲稀疏等特征是一致的。因此，鏈格孢菌經(jīng)VOCs處理后可能通過抑制MAPK信號通路從而影響其菌絲細(xì)胞壁的完整性并對壓力做出適應(yīng)性反應(yīng)，造成菌絲生長的缺陷。

真菌聚酮類化合物（polyketides，PKs）主要由真菌聚酮合酶合成，被認(rèn)為是病原體毒素和致病因子的來源[16]。例如，來自于曲霉菌的聚酮類化合物aflatoxin B1是侵染花生、玉米、水稻、大豆等多種作物的毒力因子[17]；鐮刀屬真菌產(chǎn)生的zearalenone是侵染玉米的重要毒力因子，主要通過聚酮化合物途徑合成[18]。鏈格孢菌中含有大量的聚酮合酶基因，包括PKSA（AFT_1057721）、PKSB（AFT_176278）、PKSC（AFT_1012953）、PKSD（AFT_1096114）、PKSH（AFT_976935）等，參與合成芳香族和復(fù)雜的還原型聚酮類化合物，包括alternaric acid、alternariol、macrosporin、zinnolide、 zinniol等[19-21]。本研究中，聚酮合酶基因顯著下調(diào)，說明VOCs處理后其表達(dá)受到抑制，聚酮類物質(zhì)的生物合成受阻，從而降低鏈格孢菌的毒性，保護(hù)煙株免受鏈格孢菌的脅迫。

4? 結(jié)? 論

本研究表明，暹羅芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物2-甲基丁酸和3-甲基丁酸可以顯著抑制鏈格孢菌絲的生長；與對照組相比，經(jīng)VOCs處理后的鏈格孢菌中有3461個(gè)差異表達(dá)基因；結(jié)合COG功能注釋、GO富集以及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，鏈格孢菌生長受阻與甘油酯代謝途徑、MAPK信號通路及聚酮類物質(zhì)的合成有關(guān)，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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