孫春蕾 謝瑩?dān)L

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder of pregnancy,HDP),其全球發(fā)生率為2%～8%,是孕產(chǎn)婦、胎兒和新生兒死亡的主要原因[1]。迄今為止,PE的發(fā)病機制尚不明確。公認PE是多病因、多機制、多階段發(fā)展的復(fù)雜病理過程,2014年Redman[2]提出了PE的“六階段模式”學(xué)說,其中第2階段,即妊娠第8～18周,胎盤形成異常出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),各種胎盤源性的損傷因子釋放進入母體血液循環(huán),缺血導(dǎo)致胎盤因子釋放和血管生成因子失衡,這種異常侵襲導(dǎo)致全身內(nèi)皮功能障礙[3]。因此,研究者將注意力集中在與PE相關(guān)的血管生成和病理生理異常相關(guān)的因素上,如胎盤、內(nèi)皮功能障礙以及全身炎癥等。

多年來,許多篩選試驗(臨床檢查和生物學(xué)標(biāo)志物)已被評估用于預(yù)測PE。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于篩選各種疾病的生物學(xué)標(biāo)志物,通過應(yīng)用基于質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以快速并且大規(guī)模的進行蛋白質(zhì)識別,可用于量化數(shù)千種蛋白質(zhì),并進一步確定其修飾、定位和相互作用[4]?；贛S的蛋白質(zhì)組學(xué)在增加生物學(xué)標(biāo)志物庫以發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)志物方面具有巨大潛力,這些生物學(xué)標(biāo)志物有望發(fā)掘出PE的發(fā)病途徑和分子機制,從而能夠準(zhǔn)確診斷疾病。

一、蛋白組學(xué)技術(shù)與PE疾病

基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于鑒定新的PE標(biāo)志物,并致力于分析母體血清、血漿、尿液和胎盤滋養(yǎng)層細胞。PE起源于胎盤,在胎盤水平上監(jiān)測蛋白質(zhì)變化是檢測PE的病理變化和確定相關(guān)生化途徑和機制的最佳方法[5]。因體液(如血漿、腦脊液或尿液)在體內(nèi)分布且容易獲取,常被用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究[6]。血漿和血清都是易于獲取且廉價獲得的生物液體,可以全面反映疾病狀態(tài)下器官功能的變化。尿液也是發(fā)現(xiàn)PE生物學(xué)標(biāo)志物的良好生物流體,尿蛋白質(zhì)組學(xué)可以在疾病早期階段不通過腎活檢的情況下檢測并識別腎臟疾病,是臨床研究的進一步領(lǐng)域[7]。目前,基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已鑒定出大量可能與PE有關(guān)的蛋白質(zhì)生物學(xué)標(biāo)志物,包括促血管生成因子、抗血管生成因子、胎盤生長因子、氧化與抗氧化因子及促炎性細胞因子等。因此,這些篩選出的差異蛋白還需要深入研究。

二、參與PE發(fā)病相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物

1.促血管生成因子與抗血管生成因子

(1)血管內(nèi)皮生長因子、可溶性fms樣酪氨酸激酶1與胎盤生長因子:PE是一種以抗血管生成狀態(tài)為特征的妊娠特異性疾病,抗血管生成因子(如可溶性fms樣酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosine kinase1,sFlt1)和可溶性內(nèi)皮素(soluble endoglin,sEng)的表達水平升高。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種由巨噬細胞、T淋巴細胞和滋養(yǎng)層細胞組成的蛋白質(zhì)[8]。VEGF能促進血管生成,增加血管通透性和血管擴張,從而降低血管張力和血壓[9]。Tarca等[10]的一項針對預(yù)測PE的縱向蛋白質(zhì)組學(xué)研究表示,當(dāng)使用線性混合效應(yīng)模型建模,將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為胎齡平均值的倍數(shù)后,擬合每個胎齡區(qū)間后。發(fā)現(xiàn)妊娠在22.1～28.0周時,VEGF聯(lián)合唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素6(siglec-6)和激活素-A可用來預(yù)測并區(qū)分早發(fā)型子癇前期(early onset preeclampsia,EOPE)和晚發(fā)型子癇前期(late onset preeclampsia,LOPE),敏感度為77%,假陽性率為10%。VEGF建立的血漿蛋白模型對早發(fā)型PE、重度PE和有潛在血管性胎盤病變的女性中有較高的敏感度,可在疾病早期對患者進行早期的干預(yù)和指導(dǎo)避免發(fā)展為重度PE和子癇。血管內(nèi)皮生長因子受體1的可溶性形式sFlt1,由胎盤釋放到母體血液循環(huán)中,在循環(huán)和局部組織中作為清除劑結(jié)合VEGF、胎盤生長因子(placental growth factor,PLGF),中和VEGF和PLGF的血管生成作用,阻止它們與內(nèi)皮細胞上的膜受體相互作用導(dǎo)致循環(huán)VEGF和PLGF水平降低,導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[11]。Rasanen等[12]利用多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(2D-LC-MS/MS)分析輕度、重度PE患者和正常妊娠女性的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究得出,與正常血壓妊娠比較,LOPE的患者,其妊娠早期sFlt1濃度并沒有顯著差異,也就是sFlt1的升高是從妊娠晚期才開始變化的。Lim等[13]開展的一項生物學(xué)標(biāo)志物對PE不良結(jié)局預(yù)測的綜述和Meta分析中指出,PLGF和sFlt1可能在EOPE中的預(yù)測效果更好。已經(jīng)證明PLGF和sFlt1/PLGF比值在預(yù)測PE不良結(jié)局方面表現(xiàn)良好,SROC在0.68～0.79。PE是一種異質(zhì)性疾病,這種異質(zhì)性限制了在臨床實踐中使用這些生物學(xué)標(biāo)志物,因此,在臨床實施之前,需要對結(jié)果進行進一步的標(biāo)準(zhǔn)化研究。在未來,從恢復(fù)血管生成失衡的新型臨床和治療策略入手有望改善PE患者的并發(fā)癥并延長妊娠期。

(2)內(nèi)皮素:內(nèi)皮素(Eng,CD105)是一種膜結(jié)合糖蛋白,被基質(zhì)金屬蛋白酶切割形成可溶性內(nèi)皮素(sEng),釋放到血液循環(huán)中。PE患者中血清sEng濃度的升高干擾TGF-β/ALK1(激活素受體樣激酶-1)/Eng信號通路的發(fā)展,導(dǎo)致細胞功能改變和內(nèi)皮功能障礙[14]。Rasanen等[12]利用多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(2D-LC-MS/MS)研究篩選出的差異蛋白提示,重度PE患者的Eng含量高于輕度PE患者,Eng含量可能會提示疾病的嚴(yán)重程度。Tu等[15]利用相對和絕對定量的等壓標(biāo)簽(iTRAQ)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)分析評估EOPE和LOPE患者血清蛋白質(zhì)的差異表達得出,Eng表達在EOPE中上調(diào),但在LOPE組中沒有上調(diào)。sEng可以作為EOPE篩查的預(yù)測因子。在妊娠早期通過測定sEng識別EOPE,然后立即開始阿司匹林預(yù)防,將最大限度地提高妊娠率,可以通過生物功能分析Eng所在的信號通路,對其他相關(guān)蛋白行進一步研究[16]。

2.胎盤生長因子

(1)妊娠相關(guān)血漿蛋白A:妊娠相關(guān)血漿蛋白A (PAPP-A)是胰島素樣生長因子生物利用度的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,對正常胎兒發(fā)育至關(guān)重要。PAPPA2可分解IGFBP3和IGFBP5。PAPPA2通過增加IGFBP5水解抑制胎盤細胞滋養(yǎng)層細胞的侵襲[17]。Tu等[15]利用iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS分析評估EOPE和LOPE患者血清蛋白質(zhì)的差異表達研究得出,與正常妊娠組比較,EOPE組的PAPPA2蛋白表達水平增加,在LOPE組中未檢測到差異性改變,可能PAPPA2在妊娠早期影響胎盤滋養(yǎng)層的侵襲和轉(zhuǎn)移,并導(dǎo)致胎盤功能逐漸下降。PAPP-A可早期與多普勒超聲及其他生化標(biāo)志物和母體因素結(jié)合用于PE的篩查[18]。

(2)PSG:PSG是一種妊娠特異性糖蛋白,由胎盤合胞滋養(yǎng)層細胞合成并分泌到血液中。Rong等[19]研究發(fā)現(xiàn),PSG9顯著促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的血管生成。Tu等[15]利用iTRAQ與LC-MS/MS聯(lián)合評估發(fā)現(xiàn),與正常妊娠組比較,LOPE組中PSG1和PSG9蛋白表達下調(diào)。PSG蛋白家族的下調(diào)可能通過影響內(nèi)皮細胞的增殖而參與PE的發(fā)病機制,目前針對PSG 的研究還較少,這一假設(shè)還需進一步具體實驗支持和驗證。

(3)人胎盤生乳素:人胎盤生乳素(human placental lactogen,HPL)又稱絨毛膜促生長泌乳素,由胎盤細胞滋養(yǎng)層細胞合成,主要分泌入母體血流。Bersinger等[20]研究發(fā)現(xiàn),HPL可作為監(jiān)測HDP時胎盤狀態(tài)的一個指標(biāo)。有研究利用基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF/TOF-MS)研究發(fā)現(xiàn),與正常妊娠比較,PE患者胎盤組織中HPL蛋白的表達水平降低。Li等[21]研究得出,母體血漿中HPL mRNA升高可能提示胎盤浸潤性異常相關(guān)的疾病。相反,在PE這種以胎盤淺層浸潤為特征的疾病的患者中觀察到HPL mRNA水平降低,故HPL水平的測定有可能成為妊娠后PE篩查的指標(biāo)。

(4)胎盤蛋白13:胎盤蛋白13(placental protein 13,PP13)也稱為半乳糖凝集素13(galectin-13,Gal-13)。半乳糖凝集素是一種碳水化合物結(jié)合蛋白,其家族與炎癥、免疫反應(yīng)和細胞凋亡有關(guān)。PP13在懷孕期間促進子宮動靜脈擴張,維持母體血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Giguère等[22]還通過系統(tǒng)綜述發(fā)現(xiàn),PP13與PPAP-A、整合素樣金屬蛋白酶12、激活素、抑制素和子宮動脈多普勒檢查或其他檢查相結(jié)合可以提高PE的預(yù)測效果。PP13對預(yù)測PE有一定價值,但仍需更多數(shù)據(jù)進行評估。

3.氧化劑和抗氧化因子之間的平衡

(1)線粒體蛋白:胎盤線粒體是PE氧化應(yīng)激的重要來源,線粒體脂質(zhì)過氧化增加可能導(dǎo)致PE胎盤線粒體功能障礙。線粒體功能受損,導(dǎo)致能量產(chǎn)生異常,可能是胎兒-胎盤功能障礙的關(guān)鍵因素[23]。Shi等[24]利用胎盤線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析探討重度PE病理生理學(xué),得出PE組及早產(chǎn)兒PE組過氧化還原酶3(peroxiredoxin 3,PRDX3)的蛋白表達水平分別低于正常妊娠組及足月PE組(P<0.01)。Mary等[23]通過無凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對正常妊娠和PE患者的胎盤蛋白質(zhì)組進行比較,確定了除線粒體PRDX5外,抗氧化酶的過氧化物酶(PRDX1、2、3、4、6)蛋白家族均在PE中表達上調(diào)?？寡趸降脑黾涌赡苁羌毎麑钚匝醯姆烙鶛C制的結(jié)果,而PRDX5的下調(diào)可導(dǎo)致線粒體功能障礙。此外,氧化抵抗蛋白1(oxidation resistance 1,OXR1)在氧化應(yīng)激、線粒體DNA完整性和凋亡中起作用的重要蛋白質(zhì),該蛋白在PE中被發(fā)現(xiàn)下調(diào)。這是OXR1參與PE的首次報道,然而線粒體蛋白在PE中的作用還需要進一步通過滋養(yǎng)層細胞的體外功能實驗研究來證實。

(2)對氧磷酶1:對氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1) 是一類具有高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)相關(guān)性且具有心血管保護作用的芳香酯酶,在預(yù)防心血管內(nèi)皮功能受損方面發(fā)揮重要作用。Ding等[25]應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)分析正常妊娠和PE患者的尿液樣本,得出PE患者的血清PON1較正常妊娠者蛋白表達水平升高?？紤]與PE的氧化應(yīng)激有關(guān),因為PE的病因?qū)W說之一就是氧化應(yīng)激破壞血管內(nèi)皮細胞,PE患者小血管痙攣導(dǎo)致肝臟受損,而肝臟是分泌PON1的主要器官之一,因此肝臟損害可能會導(dǎo)致肝細胞分泌 PON1的能力下降,從而PE患者的PON1表達水平增加。HDP是影響心腦血管系統(tǒng)的相關(guān)性疾病,PON1是否可以與其他影響心腦血管內(nèi)皮功能的蛋白質(zhì)一起聯(lián)合作為PE的預(yù)測蛋白,還需進一步實驗研究。

(3)熱休克蛋白:熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP)是一種高度保守的蛋白質(zhì),廣泛存在于生物體或細胞中,在蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成、細胞周期調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。HSP70參與多種生理過程,如蛋白質(zhì)折疊,并能保護細胞免于凋亡。胎盤缺血、氧化應(yīng)激和母體炎性反應(yīng)可介導(dǎo)HSP70的表達。Mary等[25]利用MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)研究得出PE患者的胎盤蛋白質(zhì)組中HSP90B1、HSPA5、HSPA9蛋白表達顯著高于正常妊娠女性。Wang等[26]評估了來自于熱休克蛋白β-1 (heat shock protein β-1,HSPB1)的差異表達肽(AEDPPE)在脂多糖誘導(dǎo)的類PE大鼠模型中的作用,發(fā)現(xiàn)AEDPPE顯著改善了PE癥狀和胎鼠結(jié)局,AEDPPE的應(yīng)用有望成為一種治療PE的新方法。

(4)視黃醇結(jié)合蛋白4:視黃醇結(jié)合蛋白4(retinol-binding protein,RBP4)是一種21kDa的蛋白質(zhì),是從肝臟到外周組織的視黃醇(維生素A)的特殊載體。Lu等[27]利用1-D凝膠聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)研究結(jié)果顯示,重度PE患者的RBP4濃度顯著低于正常妊娠女性。Transwell侵襲試驗驗證隨著RBP4濃度的升高,JEG-3細胞的侵襲能力增加。說明在PE患者胎盤發(fā)育過程中,滋養(yǎng)細胞侵襲能力降低導(dǎo)致滋養(yǎng)層無法深入侵入子宮肌層,也無法適當(dāng)重塑子宮螺旋動脈。血流減少和胎盤灌注減少會導(dǎo)致胎盤缺血,產(chǎn)生隨后的氧化應(yīng)激和血管生成失衡,RBP4濃度降低從而進一步導(dǎo)致PE患者妊娠后期內(nèi)皮功能障礙的發(fā)展。

4.促炎性細胞因子

(1)P物質(zhì):SP是具有血管擴張作用的神經(jīng)肽,通過內(nèi)分泌或旁分泌因子起作用,直接作用于血管平滑肌,引起血管舒張,血壓降低。參與多種炎癥過程,促進前列腺素E(prostaglandin E,PGE) 和一氧化氮(nitric oxide,NO)合成與釋放的作用減弱,血漿中PGE和NO等舒張血管的物質(zhì)水平顯著降低。李莉等[28]利用2-DE凝膠聯(lián)合電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS/MS)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),PE患者中P物質(zhì)蛋白表達水平低于正常妊娠女性。重度PE患者血清中SP蛋白表達下調(diào)。故作為生化指標(biāo),SP水平下降也有望成為重度子癇前期患者的診斷依據(jù)。

(2)絲氨酸蛋白酶抑制劑:Buhimschi等[29]利用表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS/MS)技術(shù)研究正常妊娠和PE患者的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)得出,在PE的尿液蛋白質(zhì)組中絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(serpin family a member 1,SERPINA1)升高。SERPINA1是一種豐富的血漿蛋白,是主要的血源性絲氨酸蛋白酶抑制劑。血清SERPINA1通過抑制激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的活性,從而導(dǎo)致全身血管收縮和高血壓。尿液中SERPINA1的片段或錯誤折疊形式除了作為生物學(xué)標(biāo)志物外,是否也是PE病理生理學(xué)表現(xiàn)的直接參與者,還需要進一步的研究來闡明。

(3)載脂蛋白A-I:Blumenstein等[30]利用ESI-Q-TOF-MS/MS技術(shù)從血清組織中測定出PE患者的樣本中載脂蛋白A-I含量升高,這也是載脂蛋白在PE患者研究中的首次報道。載脂蛋白A-I通常由胎盤細胞表達,并作為高密度脂蛋白中的主要脂蛋白,可防止脂質(zhì)氧化,促進動脈粥樣硬化病變中富含脂質(zhì)的巨噬細胞的膽固醇外流,并調(diào)節(jié)細胞黏附分子的內(nèi)皮表達。因此,在PE患者的胎盤中發(fā)現(xiàn)過表達載脂蛋白A-I可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。Blumenstein等[30]使用神經(jīng)干細胞進行了多變量分析顯示,纖維蛋白原和載脂蛋白A-I重疊于PE-AGA和PE-SGA兩個亞組。載脂蛋白A-I與其他因子的組合準(zhǔn)確地區(qū)分了那些后來因小于胎齡兒(small for gestation age,SGA)而患上PE的女性和那些沒有并發(fā)癥的妊娠女性。但因為包括的女性人數(shù)較少,這些蛋白質(zhì)組需要在更大的篩選研究中行進一步評估。

三、展 望

PE作為圍生期發(fā)生率和病死率的主要原因,加強對PE的病因、預(yù)測、預(yù)防和治療的研究是世界各國研究人員的重要任務(wù)。目前,基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)被廣泛應(yīng)用于PE的研究中?；贛S的蛋白質(zhì)組學(xué)在增加PE生物學(xué)標(biāo)志物庫以及創(chuàng)建一組生物學(xué)標(biāo)志物方面具有巨大潛力,許多可能與PE有關(guān)的蛋白質(zhì)生物學(xué)標(biāo)志物已經(jīng)被確定,其中VEGF、sFlt-1、PLGF、sENG、PAPP-A、PP13、HSP70等蛋白標(biāo)志物有望代表PE的多種途徑和分子機制,從而能夠準(zhǔn)確診斷疾病,詳見表1?；贛S的蛋白質(zhì)組學(xué)還可以通過將已有的蛋白質(zhì)生物學(xué)標(biāo)志物聯(lián)合起來,建立該疾病的蛋白質(zhì)模型從而達到疾病預(yù)測的效果。另外,MS作為一種高通量的檢測,結(jié)合GO注釋和KEGG分析出富集蛋白較多的通路,例如像炎癥、脂質(zhì)調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激等,可研究通路的上下游相關(guān)蛋白質(zhì),從而作為一種可篩選新的差異蛋白的方法。然而,使用已知的活動性疾病生物學(xué)標(biāo)志物進行妊娠早期篩查,對后續(xù)PE的發(fā)展預(yù)測較少,今后需要開發(fā)針對特定胎盤、血管和轉(zhuǎn)運蛋白的新免疫分析方法可能顯著改善PE的早期預(yù)測,有必要通過開展深入的臨床試驗、實驗和組學(xué)分析予以證實。

表1 用于預(yù)測或檢測母體樣本中PE的潛在生物學(xué)標(biāo)志物總結(jié)