侯魁元 鄧賀民 劉建勇 蘇 穎 王偉君 曲 藝 王丹丹 焦 樂(lè)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤,盡管手術(shù)加術(shù)后放化療技術(shù)的提高,但是其預(yù)后差,治療效果仍不令人滿意[1]。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是公認(rèn)的膠質(zhì)瘤臨床一線化療藥物,在細(xì)胞中TMZ通過(guò)破壞DNA和誘發(fā)程序性細(xì)胞死亡發(fā)揮抗腫瘤作用,具體在鳥(niǎo)嘌呤的N7和O6位點(diǎn)以及腺嘌呤的N3位置對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行烷基化,并在隨后的復(fù)制周期中誘導(dǎo)核苷酸錯(cuò)配及細(xì)胞DNA修復(fù)失效,并促進(jìn)細(xì)胞周期在G2/M期阻滯,導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡[2]。但是多重耐藥性(multiple drug resistance,MDR)在TMZ治療過(guò)程中仍不可避免發(fā)生,文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)膠質(zhì)瘤患者,TMZ的MDR發(fā)生率高達(dá)50%左右,成為膠質(zhì)瘤局部侵襲、復(fù)發(fā)和預(yù)后不佳的重要原因[3]。TMZ耐藥除了O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)等DNA修復(fù)機(jī)制介導(dǎo)外,生存自噬、MicroRNA、膜的離子泵、膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性等都參與了TMZ耐藥的發(fā)生[4]。如何降低或延緩MDR在TMZ應(yīng)用中的發(fā)生,提高TMZ療效成為目前急于解決的重要臨床問(wèn)題。

目前根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,TMZ與其他抗腫瘤藥物/療法結(jié)合應(yīng)用已成為治療膠質(zhì)瘤的主要策略之一,用以抵抗MDR的發(fā)生[5]。聯(lián)合治療的基本原理是使用通過(guò)靶向和TMZ不同藥理機(jī)制的其他關(guān)鍵分子或通路,如調(diào)控FOXM1-survivin軸、PI3K/Akt信號(hào)通路的活性,從而增加TMZ的療效,降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞MDR的發(fā)生[6]。PDT是目前治療腫瘤的新興手段,主要機(jī)制通過(guò)光照激活光敏劑后產(chǎn)生具有生物活性的ROS,主要有超氧陰離子(O2·-)、過(guò)氧化氫(H2O2)等,ROS產(chǎn)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死、滋養(yǎng)血管閉塞、免疫反應(yīng)等,在膠質(zhì)瘤治療中顯示了廣闊的前景[7, 8]。既往研究表明,PDT可以促進(jìn)TMZ對(duì)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制和殺傷效應(yīng)[9]。本研究旨在進(jìn)一步觀察研究PDT是否能提高TMZ作用后的人源的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞內(nèi)ROS總量,從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感度。

材料與方法

1.試劑和材料:膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251由黑龍江省北方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心獲得,高糖培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自美國(guó)HyClone公司,胎牛血清(foetal bovine serum,FBS),購(gòu)自美國(guó)BI公司,光敏劑5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolevulinic acid, 5-ALA) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,用無(wú)血清培養(yǎng)基將其溶解為 0.4mmol/L于 4℃保存。CCK-8 kit 試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司,ROS探針購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,MMP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司, 細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶購(gòu)自無(wú)錫耐思生物科技有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng):膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251用含10% FBS加1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM的培養(yǎng)基,置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞分組及處理:取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞,胰酶常規(guī)消化后鋪在培養(yǎng)板中(依據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容采用96或6孔板)繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)處理因素不同,細(xì)胞分為5組,即對(duì)照(control)組(無(wú)特殊處理),TMZ組(TMZ 80μmol/L),PDT組 (5-ALA 0.4mmol/L,0.5J/cm2,激光波長(zhǎng)635nm), TMZ+Laser組(TMZ 80μmol/L, Laser 0.5J/cm2,波長(zhǎng)635nm),TMZ+PDT組(TMZ 80μmol/L, Laser 0.5J/cm2,5-ALA 0.4mmol/L,波長(zhǎng)635nm)。PDT過(guò)程:5-ALA 孵育4h,用磷酸鹽緩沖溶液 (PBS) 清洗3次后加入DMEM, 激光照射(能量密度0.5J/cm2,照射波長(zhǎng) 635nm),全程避光操作。

4.細(xì)胞活性檢測(cè):將上述細(xì)胞分組及處理后的各組細(xì)胞接種于96孔板,分別在不同時(shí)間點(diǎn)(4、8、12、16、24h),每孔加入 CCK-8溶液10微升/孔,同時(shí)設(shè)復(fù)孔,37℃培養(yǎng)箱孵育1h,酶標(biāo)儀測(cè)定(波長(zhǎng)450nm)光密度(OD)值。

5.侵襲實(shí)驗(yàn):Transwell小室(8.0μm)的上室加入細(xì)胞分組及處理后的含無(wú)血清DMEM的膠質(zhì)瘤細(xì)胞(1×105個(gè)/毫升)200μl,下室(24孔板)填充500μl含有10%血清的DMEM,注意排凈下室的氣泡,37℃培養(yǎng)24h;擦除小室內(nèi)壁的細(xì)胞,晾干,放入95%乙醇中固定5min,磷酸鹽緩沖液慢洗3次,室溫下晾干,結(jié)晶紫(0.4%,800微升/孔)染色30min,純凈水淋洗,倒置顯微鏡觀察穿透細(xì)胞個(gè)數(shù)。

6.細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè):處理后的細(xì)胞去除培養(yǎng)液,加載DCFH-DA工作液(無(wú)血清 DMEM 稀釋至1∶1000)覆蓋,量以充分覆蓋細(xì)胞即可,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20min,用無(wú)血清DMEM輕輕洗滌3次,DAPI(1∶50)復(fù)染 15min,PBS洗3min,熒光顯微鏡下(488nm/525nm檢測(cè)波長(zhǎng))檢測(cè)DCF熒光。

7.線粒體膜電位MMP檢測(cè):按上述各組處理后的細(xì)胞,按說(shuō)明書(shū)使用,采用線粒體tracker (50nmol) 染色 30min,PBS洗滌3次,充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光染料?；罴?xì)胞工作站檢測(cè),熒光數(shù)據(jù)用Image pro Plus軟件分析。

結(jié) 果

1.細(xì)胞活力的影響:如圖1所示,CCK-8實(shí)驗(yàn)表明在TMZ處理后的4～8h,細(xì)胞OD值(細(xì)胞活力)下降,8h后,細(xì)胞OD值有升高的趨勢(shì),即產(chǎn)生了膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的治療抵抗。筆者前期檢測(cè)了不同劑量PDT對(duì)U251的影響,當(dāng)0.5J/cm2時(shí)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞僅有輕度抑制,因此選用此劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2表明,當(dāng)PDT協(xié)同應(yīng)用于TMZ處理8h的U251細(xì)胞后,PDT+TMZ組OD值最低(0.7242±0.0886),與TMZ組(0.9379±0.1189)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),與control組(1.164±0.1309)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),說(shuō)明PDT明顯提高了TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用,延緩了MDR的發(fā)生。

圖1 TMZ作用后 U251細(xì)胞活力變化

圖2 不同組別U251細(xì)胞活力比較*P<0.01,**P<0.001

2.細(xì)胞侵襲:利用Transwell小室進(jìn)一步觀察PDT能否提高U251的侵襲抑制(圖3)。TMZ+PDT

圖3 不同組別 U251細(xì)胞侵襲能力變化(結(jié)晶紫染色,×100)

組侵襲的細(xì)胞分別與control組(3313±377.9)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),與TMZ組(2023±547.4)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。表明PDT存在下,提高了TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的侵襲抑制。

圖4 不同組別 U251細(xì)胞侵襲數(shù)量比較*P<0.05,**P<0.001

3.ROS表達(dá): PDT+TMZ組的ROS水平(6637±2317)高于control組(2734±1584,P<0.001)和TMZ組(4433±2333,P<0.01)。說(shuō)明在PDT協(xié)同下,TMZ增加了U251細(xì)胞內(nèi)源性ROS的水平,提高了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激能力(圖5)。

圖5 不同組別的U251細(xì)胞內(nèi)ROS水平*P<0.01,**P<0.001

4.細(xì)胞內(nèi)MMP水平:MMP是細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)志,本研究中PDT+TMZ組MMP水平(10454±1831)分別低于TMZ組(22037±5138,P<0.01)和control組(32076±9374,P<0.001),進(jìn)一步分析表明,ROS 與MMP水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.559,P<0.05)。表明協(xié)同治療通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平后轉(zhuǎn)向了加速膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡的過(guò)程,從而延緩MDR的發(fā)生(圖6～圖8)。

圖6 U251細(xì)胞MMP變化(×100)A.線粒體tracker;B.光鏡

圖7 不同處理后 U251細(xì)胞MMP比較*P<0.01,**P<0.001

圖8 細(xì)胞內(nèi)ROS與MMP水平關(guān)系

討 論

TMZ和其他常規(guī)化療藥物通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞DNA和誘發(fā)程序性細(xì)胞死亡在細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用。雖然TMZ臨床研究取得了令人興奮的結(jié)果,為提高膠質(zhì)瘤療效帶來(lái)了新的曙光,但是膠質(zhì)瘤的延遲進(jìn)展及腫瘤MDR對(duì)TMZ療效的限制并沒(méi)有轉(zhuǎn)化為患者整體生存期的延長(zhǎng)[10]。聯(lián)合治療有可能成為改善膠質(zhì)瘤預(yù)后的重要措施之一[11]。如將TMZ與蛋白酶體抑制劑(硼替佐米)、阿帕替尼、貝伐單抗等低分子物質(zhì)連用,可提高TMZ的療效,但是很多抗腫瘤藥物都有一定的毒性不良反應(yīng),如血小板計(jì)數(shù)減少、嘔吐、轉(zhuǎn)氨酶升高、腎功能異常等[12, 13]。而PDT過(guò)程中,光敏劑只在局部激活,治療反應(yīng)僅發(fā)生于光照區(qū)域,正常組織毒性低、無(wú)交叉耐藥等特點(diǎn),較傳統(tǒng)化療藥物有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

本研究發(fā)現(xiàn),TMZ作用于人源膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞可使細(xì)胞活力短暫下降8h,但是隨著時(shí)間的進(jìn)行,8h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的耐受,導(dǎo)致細(xì)胞活性開(kāi)始逐漸恢復(fù),即明顯的TMZ治療抵抗現(xiàn)象。但是聯(lián)合PDT(0.5J/cm2)后,卻明顯增加了TMZ對(duì)U251細(xì)胞的毒性作用,抑制了U251細(xì)胞對(duì)TMZ的耐藥。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確了U251細(xì)胞對(duì)TMZ耐受的臨界時(shí)間點(diǎn)和PDT增加TMZ細(xì)胞毒性的增敏效應(yīng)。研究表明,PDT能增加U251細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感度提高其細(xì)胞毒性作用。侵襲和遷移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)行為,進(jìn)一步利用Transwell小室研究表明,PDT+TMZ能明顯抑制U251的侵襲,與單獨(dú)TMZ和對(duì)照組比較,這些結(jié)果表明PDT不僅提高了TMZ對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制,也抑制了細(xì)胞的局部侵襲發(fā)生。國(guó)內(nèi)其他相關(guān)研究也得到了類似的結(jié)果,徐文虎等[14]研究發(fā)現(xiàn)香葉木苷能通過(guò)核因子κB(nuclear factor kappa-B(NF-κB)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用?？傊?利用避免具有交叉抗性的藥物或療法可以增強(qiáng)TMZ抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的療效,延緩MDR的發(fā)生,本研究為提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感度提供了新的實(shí)驗(yàn)方案。

TMZ的藥理作用是通過(guò)甲基化腫瘤細(xì)胞DNA,使DNA修復(fù)障礙,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,此外Lo Dico等[15]研究表明氧化應(yīng)激也參與了其藥理機(jī)制, TMZ與線粒體ROS清除劑聯(lián)合使用在U251敏感細(xì)胞中,通過(guò)抑制線粒體ROS釋放,削弱TMZ處理介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng),這表明線粒體至少是TMZ反應(yīng)元件之一。但是ROS在腫瘤細(xì)胞中是一把雙刃劍,研究表明與生長(zhǎng)、分化、存活等相關(guān)的多種氧化還原依賴性途徑的調(diào)節(jié)因子和路徑相關(guān),如研究ROS 低劑量時(shí)激活存活通路,如NF-κB,PI3K/Akt等,高劑量時(shí)激活腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFr)、caspase凋亡通路,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。雖然避免交叉抗性是治療腫瘤耐藥的重要策略,有研究表明,無(wú)論腫瘤耐藥的潛在機(jī)制如何,調(diào)節(jié)ROS水平是一種靶向和致敏 MDR 腫瘤細(xì)胞的有效方法,該方法對(duì)表達(dá)高水平 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、表皮生長(zhǎng)因子受體突變的耐藥腫瘤細(xì)胞具有敏感度和殺傷性[17,18]。這些提示提高細(xì)胞內(nèi)多源ROS的表達(dá),有可能成為增加TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞療效的關(guān)鍵因素之一。大量文獻(xiàn)表明,ROS的產(chǎn)生和釋放是PDT的主要生物作用介質(zhì),后者可以對(duì)多種腫瘤起到抑制作用,如膠質(zhì)瘤、胃癌、腎癌等[19,20]。

本研究發(fā)現(xiàn),PDT聯(lián)合TMZ增加了細(xì)胞內(nèi)總ROS的含量,根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道表明細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS 的上調(diào),導(dǎo)致溶酶體的破壞,進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,鈣離子超載可能會(huì)使線粒體凋亡向壞死轉(zhuǎn)變,同時(shí)ROS氧化應(yīng)激在細(xì)胞內(nèi)的累積可能也會(huì)觸發(fā)自噬、凋亡和壞死之間的相互轉(zhuǎn)化,具體死亡形式之間的轉(zhuǎn)化機(jī)制待后續(xù)更深入的研究加以闡述。上述理論可能是PDT增加TMZ對(duì)U251細(xì)胞增殖抑制,延緩TMZ應(yīng)用過(guò)程中后續(xù)MDR發(fā)生的重要原因,本研究結(jié)果為解決膠質(zhì)瘤的MDR提出了一種新的實(shí)驗(yàn)策略。盡管有研究也發(fā)現(xiàn)耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)ROS比敏感細(xì)胞水平高,但是膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)具有高水平的抗ROS能力的各種酶類,如過(guò)氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶等,這是耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞保持穩(wěn)態(tài)因素之一,也是使TMZ的藥效發(fā)揮受阻礙,是膠質(zhì)瘤獲得性耐藥的一個(gè)原因[21]。Brunetti等[22]研究也發(fā)現(xiàn),異呋喃二烯與替莫唑胺協(xié)同誘導(dǎo)使細(xì)胞內(nèi) ROS 水平的增加,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞壞死增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡。

研究表明,ROS可破壞線粒體膜,導(dǎo)致產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激,從而啟動(dòng)線粒體途徑的Bax/細(xì)胞色素C/caspase-3經(jīng)典細(xì)胞凋亡途徑。線粒體膜兩側(cè)離子濃度差異所產(chǎn)生的跨膜電位差即MMP,是反映線粒體功能狀態(tài)的重要指標(biāo)。Salmerón等[23]研究表明,MMP可以選擇性地光損傷一些參與凋亡的蛋白質(zhì),如caspase-3、caspase-8、p38-MAPK等。本研究中發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)TMZ及對(duì)照組比較,PDT+TMZ能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)MMP的水平,說(shuō)明聯(lián)合協(xié)同治療激活了膠質(zhì)瘤細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生,筆者推測(cè)是細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的ROS 引發(fā)各種氧化應(yīng)激反應(yīng),改變線粒體膜通透性,也包括激活內(nèi)源性的半胱天冬酶,這增加了TMZ應(yīng)用于膠質(zhì)瘤過(guò)程中PDT輔助下抑制發(fā)生MDR的新證據(jù)。

綜上所述,本研究表明在PDT作用下,TMZ增加了膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平,提高了膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感度,延緩了MDR的發(fā)生,為臨床克服TMZ化療過(guò)程中出現(xiàn)的MDR 提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而黃天造等[24]研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激可以增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞保護(hù)性自噬來(lái)對(duì)TMZ產(chǎn)生抵抗,說(shuō)明氧化應(yīng)激在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)存在著復(fù)雜作用,后續(xù)有待繼續(xù)開(kāi)展深入研究。