劉治華 韋麗萍 田慧虹 蔡慧敏 聶 坤 張玉虎 王麗娟 王麗敏

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩及姿勢障礙等運動癥狀,同時合并焦慮、抑郁、睡眠障礙等非運動癥狀。目前認為這些癥狀背后的生理、病理機制是中腦多巴胺神經(jīng)元在遺傳和環(huán)境因素相互作用下出現(xiàn)變性、凋亡及壞死,造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多巴胺及乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的失衡[1,2]。藥物治療雖能短暫糾正PD的癥狀,但隨著病情進展,患者會出現(xiàn)諸如癥狀波動、異動癥、幻覺等不良反應,嚴重影響患者生活質(zhì)量,加重家庭和社會的負擔[3,4]。近年來,在黒質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中移植能夠分泌多巴胺的細胞,提高腦內(nèi)多巴胺的濃度是研究的熱點[5]。然而,移植細胞僅5%～20%的存活率成為細胞移植治療的一個難題,尋找基因轉(zhuǎn)染等方法可能是提高移植物存活率及功效的手段之一[6]。富含亮氨酸重復激酶2(leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2)基因是常染色體顯性遺傳性PD最常見致病基因[7]。

研究表明,LRRK2基因突變會增加核糖體蛋白磷酸化,影響α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)生成和聚集,介導對多巴胺能神經(jīng)元變性從而參與PD的發(fā)生[8]。而Di Maio等[9]研究發(fā)現(xiàn),即使無LRRK2突變的特發(fā)性PD患者也存在LRRK2蛋白過度激活,提示LRRK2在PD進展中可能發(fā)揮重要作用,可能會影響細胞移植后細胞在生物體內(nèi)的存活。而近年來成簇規(guī)律間隔的短回文序列(CRISPR)基因編輯技術(shù)成為生物醫(yī)學領域的熱門技術(shù)之一,其修飾的基因具有可遺傳性,能使移植細胞增殖的后代維持基因穩(wěn)定,有望提高PD基因修飾治療的效果。因此,本研究將經(jīng)CRISPR/Cas9單載體慢病毒轉(zhuǎn)染敲除LRRK2基因的PC12細胞立體定向植入PD模型大鼠右側(cè)紋狀體中探究其對PD大鼠運動癥狀的改善程度及潛在的作用機制,為PD基因修飾的細胞移植治療提供一種新的選擇。

材料與方法

1.動物與耗材、試劑:SPF級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠32只,8周齡,體質(zhì)量280～330g,由武漢斯萊克斯動物公司提供。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院動物倫理學委員會審批(倫理學審批號:2018351A)。魚藤酮購自美國Sigma公司; PC12細胞來源于中山大學第二附屬醫(yī)院;CRISPR/Cas9單載體慢病毒購自上海吉凱基因公司; 酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體、α-tubulin抗體購自武漢三鷹生物公司; 山羊抗兔抗體購自美國Affinity公司;葵花油購自上海源葉生物科技有限公司;曠場裝置及動物行為學分析系統(tǒng)購自北京眾實迪創(chuàng)科技公司;微型顱骨鉆、腦立體定位儀、單通道微量注射泵購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

2.細胞培養(yǎng):10%滅活小牛血清、5%滅活馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PC12細胞,當細胞密度達到70%～80%時進行傳代培養(yǎng)。

3.實驗分組及轉(zhuǎn)染:細胞分為正常對照組(正常PC12細胞)、陰性對照組(加空載體慢病毒)、LRRK2-KO組(加入CRISPR/Cas9單載體慢病毒)。細胞接種于6孔板,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細胞融合度達到60%～70%進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染3天后,5μg/ml嘌呤霉素篩選,后提取各組細胞蛋白進行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測LRRK2蛋白的表達,測定LRRK2基因轉(zhuǎn)染后的敲除效率。其中LRRK2-sgRNA序列為上游引物:5′-CACCGCACACTGGCGACTTCTCATGT-3′;下游引物:5′-AAACACATGAGAGTCGCCAGTGTGC-3′[10]。

4.動物模型構(gòu)建及分組:Excel表隨機抽取6只作為正常對照組(不做處理,n=6),剩余26只大鼠進行造模。將魚藤酮于葵花油乳液中配置成質(zhì)量濃度1.5mg/ml的混懸液,SD大鼠以1.5mg/(kg·d)濃度頸背部皮下連續(xù)注射4周,每周注射6次,造模結(jié)束第2天用爬桿試驗對大鼠進行篩選,評分在1.5～2.0分視為PD模型制作成功。將篩選后大鼠隨機分成3組,分別為PD模型組(不做其他處理,n=6)、LRRK2敲除組(注射敲除LRRK2基因的PC12細胞,n=6)、LRRK2正常組(注射正常的PC12細胞,n=6)。注射方法:大鼠固定于定位儀上,暴露前囟,根據(jù)腦圖譜在右側(cè)紋狀體 (AP:0.2mm,ML:2.8mm,DV:-6.0mm)鉆孔,注射流量為1μl/min,共注射5min[11]。LRRK2正常組和LRRK2敲除組兩組大鼠注射的細胞數(shù)量均約為2.0×105。

5.小鼠運動功能評估:(1)曠場試驗:大鼠放置在曠場反應箱正中心,觀察5min內(nèi)大鼠活動情況。測定指標包括運動總距離以及運動平均速度。(2)爬桿試驗:爬桿試驗用直徑為35mm、高1000mm的頂端球形的木質(zhì)圓柱,周圍纏繞繃帶,實驗中將圓柱直立,大鼠頭朝下置于頂部,讓其從頂部沿桿爬至桿底部,觀察其行為并計分。計分標準:四肢并用沿桿順利爬下為0分;螺旋向下爬行但有后肢滑行為0.5分;上桿后停頓趴下但可抱桿為1分;滑行后掉落為1.5分;直接掉落為2.0分[12]。每只大鼠爬桿兩次取其平均分。

6.Western blot法:行為學檢測后當天將大鼠處死、取腦,將分組大鼠右側(cè)紋狀體組織處理后加入RIPA裂解液裂解提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度、電泳、轉(zhuǎn)膜;封閉后加入一抗、二抗孵育;ECL試劑盒顯影,Image J軟件分析條帶。

7.免疫組織化學檢測:將大鼠處死、取腦,多聚甲醛固定,按組化步驟制備蠟塊,冠狀位于紋狀體區(qū)相同位置進行切片,按照組化標準步驟進行TH染色。Image-Pro Plus 6.0.0.260軟件分各組紋狀體區(qū)TH染色的平均吸光度值(MOD),其中MOD(%)=積分吸光度值/面積×100% ]。

結(jié) 果

1.慢病毒轉(zhuǎn)染后不同組的PC12細胞LRRK2蛋白的表達情況:Western blot法結(jié)果顯示,LRRK2蛋白表達含量在正常對照組和陰性對照組中表達明顯高于LRRK2-KO組(P<0.05);而陰性對照組與正常對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖1)。

圖1 各組PC12細胞LRRK2蛋白表達結(jié)果A.LRRK2蛋白Western blot 法條帶圖;B.LRRK2蛋白Western blot 法條帶灰度值統(tǒng)計圖

2.右側(cè)紋狀體立體定向注射1周后對各組大鼠運動功能的影響:通過曠場試驗和爬桿試驗分別檢測了各組在干預1周后大鼠運動功能的變化。在曠場試驗中,PD模型組大鼠的運動總路程以及平均速度顯著小于正常對照組(P<0.05),而LRRK2敲除組與PD模型組比較,運動總路程延長以及平均速度增大,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而LRRK2正常組與PD模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義;在爬桿試驗中,PD模型組大鼠的爬桿試驗評分顯著小于正常對照組(P<0.05),而LRRK2敲除組大鼠的爬桿試驗評分與PD模型組大鼠比較有顯著提升(P<0.05),而LRRK2正常組與PD模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖2)。

圖2 各組大鼠曠場試驗和爬桿試驗的結(jié)果A.各組大鼠曠場試驗運動總路程的比較;B.各組大鼠曠場試驗運動平均速度的比較;C.各組大鼠爬桿實驗的評分比較

3.右側(cè)紋狀體立體定向注射1周后對大鼠右側(cè)紋狀體TH表達的影響:TH在PD模型組中表達明顯低于正常對照組(P<0.05);與PD模型組比較,LRRK2敲除組的紋狀體TH表達含量顯著增加(P<0.05),而LRRK2正常組與PD模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖3)。

4.右側(cè)紋狀體立體定向注射1周后大鼠右側(cè)紋狀體凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和Bcl-2水平的變化:caspase-3在PD模型組中表達明顯高于正常對照組(P<0.05);與PD模型組比較,LRRK2敲除組的caspase-3表達含量顯著減少(P<0.05),而LRRK2正常組雖有下降,但是差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Bcl-2在PD模型組中的表達含量顯著小于正常對照組;與PD模型組比較,LRRK2敲除組的Bcl-2表達含量顯著增加(P<0.05),而LRRK2正常組雖有上升,但是差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖4)。

圖4 各組大鼠腦紋狀體組織凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和Bcl-2 蛋白的表達變化A.Bcl-2、caspase-3蛋白Western blot法條帶圖;B.Bcl-2蛋白Western blot法灰度值;C.caspase-3蛋白Western blot法灰度值

5.右側(cè)紋狀體立體定向注射1周后大鼠右側(cè)紋狀體HE染色:敲除LRRK2基因的PC12細胞立體定向注射右側(cè)紋狀體1周后各組PD大鼠紋狀體區(qū)HE染色詳見圖5,結(jié)果顯示,LRRK2敲除組移植區(qū)中觀察到細胞核聚集的區(qū)域,推測PC12細胞在移植區(qū)存活,而LRRK2正常組移植區(qū)中PC12細胞的存活狀況較之干預稍差。

圖5 各組大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)HE染色結(jié)果(×100)A.正常對照組;B.PD模型組;C.LRRK2正常組;D.LRRK2敲除組

討 論

PD動物模型是研究PD發(fā)病機制及干預療效的重要工具。魚藤酮會選擇性對黒質(zhì)紋狀體多巴胺能通路產(chǎn)生毒性作用,誘導大鼠出現(xiàn)類似于PD的癥狀及組織化學變化[13]。一項研究用不同劑量(1.0、1.5、2.0mg/kg)魚藤酮構(gòu)建PD大鼠模型,結(jié)果1.5mg/kg皮下注射造模效果佳且死亡率低[14]。因此本實驗用1.5mg/kg濃度魚藤酮誘導慢性PD大鼠模型,大鼠右側(cè)紋狀體TH染色與行為學結(jié)果表明本實驗慢性PD大鼠模型的構(gòu)建成功。

LRRK2基因是晚發(fā)型常染色體顯性遺傳性PD最常見致病基因。研究表明,LRRK2過表達會誘導神經(jīng)元產(chǎn)生毒性物質(zhì),引起神經(jīng)元受損或直接導致神經(jīng)元死亡[15]。一項動物實驗發(fā)現(xiàn)大鼠紋狀體中用腺病毒介導LRRK2 G2019S突變引起的黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元退化及神經(jīng)元凋亡可通過LRRK2激酶抑制劑來預防[16]。近年來,LRRK2激酶抑制劑在PD治療方面取得了極大進展,然而這些研究聚焦于在翻譯水平上抑制LRRK2蛋白,而直接調(diào)控LRRK2基因的細胞移植的研究尚無報道。本實驗在移植術(shù)后1周,移植敲除LRRK2基因PC12細胞的PD大鼠自主運動能力增強,握桿能力提升。而移植正常PC12細胞的大鼠運動功能與PD造模組未表現(xiàn)出差異,表明在1周的時間點,移植敲除LRRK2基因的PC12細胞能夠改善PD大鼠的運動功能且比單純植入PC12細胞有更好的療效。進一步觀察右側(cè)紋狀體TH染色結(jié)果,發(fā)現(xiàn)移植正常PC12細胞的紋狀體中TH含量未見明顯上升。既往研究中單純植入PC12細胞引起6-OHAD誘導的PD大鼠模型行為學改變的時間通常為3～4周,推測正常PC12細胞移植1周后對于紋狀體區(qū)TH的影響尚未達到能引起行為癥狀改變的程度,而修飾LRRK2基因后進行移植可提高移植細胞的功效[17]。

在PD發(fā)生、發(fā)展過程中,細胞凋亡是多巴胺能神經(jīng)元丟失的重要病理機制之一。有大量證據(jù)表明,LRRK2參與如囊泡運輸、自噬、細胞凋亡等過程[18]。而過度表達的LRRK2可引起神經(jīng)退行性變,增加細胞凋亡的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示移植LRRK2敲除的PC12細胞于PD大鼠右側(cè)紋狀體后可增加Bcl-2的表達,抑制caspase-3的激活,細胞凋亡受到抑制。HE染色發(fā)現(xiàn)移植區(qū)有大量細胞核聚集, PC12細胞敲除LRRK2移植后在紋狀體區(qū)中細胞的存活率較高,提示敲除LRRK2可提高PC12細胞移植的存活率。路易小體形成是PD的病理表現(xiàn)之一,其是以錯誤折疊和聚集的α-syn為特征的蛋白包涵體[20]。研究表明,LRRK2可影響α-syn的磷酸化狀態(tài),促進α-syn的聚集,加劇α-syn的毒性[21]。另外LRRK2可通過調(diào)節(jié)α-syn的攝取平衡進而影響α-syn在神經(jīng)元細胞間的傳遞[22]。因此當LRRK2敲除后,可能阻斷了紋狀體區(qū)中α-syn在PC12細胞間的傳遞和擴散,減少了其對PC12細胞的毒性影響,提高移植細胞的存活率。亦有研究表明Bcl-2表達的增加可防止多巴胺神經(jīng)元的毒性損傷,免受神經(jīng)毒素誘導的死亡[23]。而本研究中紋狀體中較高水平的Bcl-2可能減少了α-syn對PC12細胞的持續(xù)性毒性損傷,減少移植細胞的凋亡,間接增強細胞移植物的療效。

綜上所述,基于CRISPR/CAS9技術(shù)敲除LRRK2基因的PC12細胞注射紋狀體后,能在1周的時間點改善PD模型大鼠的運動功能,使TH在紋狀體中表達含量升高,降低移植后紋狀體中細胞凋亡的發(fā)生率。本研究可為PD基因修飾的細胞移植治療提供新的思路和方法,而其深層次的作用機制仍需開展進一步研究予以證實。