彭 璇 付 榮

狼瘡腎炎(lupus nephritis, LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)最常見(jiàn)的嚴(yán)重器官損害,也是導(dǎo)致SLE高死亡風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵因素[1]?，F(xiàn)有治療方案僅對(duì)70%～80%的患者有效,仍有10%～15%患者會(huì)在10年內(nèi)進(jìn)展至終末期腎病[2]。LN的療效欠佳與其發(fā)病機(jī)制尚不清楚是否有關(guān)。因此,深入研究LN發(fā)病機(jī)制,對(duì)探索LN新的治療靶點(diǎn)及開(kāi)發(fā)新治療手段具有重要意義。

LN中循環(huán)免疫復(fù)合物沉積于腎小球中,通過(guò)激活補(bǔ)體經(jīng)典活化途徑,募集炎癥細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等,誘導(dǎo)產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子參與LN的發(fā)生、發(fā)展[3]。細(xì)胞焦亡是由各種危險(xiǎn)信號(hào)誘導(dǎo)的一種程序性細(xì)胞死亡,被激活后可在質(zhì)膜上穿孔導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和最終裂解,隨后釋放細(xì)胞內(nèi)容物尤其是炎性介質(zhì)如IL-1β和IL-18,引起周?chē)M織產(chǎn)生劇烈的炎性反應(yīng)[4]。NLRP3炎性小體是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的傳感器之一,既往研究發(fā)現(xiàn),LN患者腎組織中NLRP3炎性小體通路過(guò)度活化,NLRP3抑制劑可改善狼瘡模型小鼠的蛋白尿和腎臟組織學(xué)病變[5]。caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑為經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑,在Pristane誘導(dǎo)的狼瘡小鼠模型中,caspase-1敲除小鼠并沒(méi)有表現(xiàn)出狼瘡樣特征[6]。這些研究表明,細(xì)胞焦亡在LN的發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展中起到重要作用。

本研究通過(guò)對(duì)NCBI的基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus, GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中LN腎小球的基因芯片數(shù)據(jù)(GSE32591)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,篩選出正常對(duì)照(NC)組與LN組之間的差異表達(dá)基因(differential expressed genes, DEGs),與細(xì)胞焦亡相關(guān)基因取交集,得到細(xì)胞凋亡相關(guān)DEGs,進(jìn)一步進(jìn)行GO (Gene Ontology)和KEGG(The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能富集、Hub基因等分析。利用CIBERSORT分析腎小球中22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況,探討Hub基因與免疫細(xì)胞的關(guān)系,為疾病認(rèn)識(shí)、藥物開(kāi)發(fā)等提供新的思路。

材料與方法

1.一般資料/材料:在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索數(shù)據(jù),選擇標(biāo)準(zhǔn)包括:①數(shù)據(jù)集包含正常對(duì)照腎活檢組織和LN腎活檢組織;②樣本種屬為Homo sapiens;③基因表達(dá)式矩陣。按照這些標(biāo)準(zhǔn)篩選出數(shù)據(jù)集GSE32591,基于GLP14663平臺(tái),選取其中腎小球的基因表達(dá)情況,包括正常對(duì)照(NC)14例,LN 32例。臨床病例:選取符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR) SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)腎活檢證實(shí)的LN患者,排除合并其他自身免疫性疾病。以腎腫瘤手術(shù)切除的腫瘤外正常腎組織為對(duì)照,利用腎穿刺活檢用于病理診斷剩余的切片進(jìn)行檢測(cè)。本研究通過(guò)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。材料:CASP1(ab62698)、TLR2(ab213676)、MYD88(ab133739)及山羊抗兔IgG-Alexa Fluor488(ab199091)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

2.細(xì)胞焦亡DEGs的篩選:利用R語(yǔ)言(版本5.3)通過(guò)“Limma”R包進(jìn)行基因表達(dá)矩陣的標(biāo)準(zhǔn)化和差異表達(dá)分析。篩選出Padj.<0.05且|log2FC|>1的DEGs,并與GeneCards網(wǎng)站下載細(xì)胞焦亡相關(guān)基因取交集,得到細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs,利用“ggplot2”R包繪制火山圖和韋恩圖,“ComplexHeatmap”R包繪制熱圖。

3. GO和KEGG富集分析:GO富集分析由細(xì)胞成分(cellular component, CC)、生物學(xué)過(guò)程(biology process,BP)和分子功能(molecular funtion,MF)3個(gè)方面組成,幫助探討一組基因之間潛在聯(lián)系和相互作用[7]。KEGG是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù),可說(shuō)明分子生物學(xué)意義和功能[8]。GO和KEGG富集分析利用“clusterProfiler”R包完成[9]。Padj.<0.05的通路視為有意義,“ggplot2”R包對(duì)結(jié)果可視化。

4. PPI網(wǎng)絡(luò)搭建及關(guān)鍵分子篩選:利用網(wǎng)站基因分析工具STRING構(gòu)建DEGs的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)。導(dǎo)出PPI分析數(shù)據(jù)至Cytoscape (版本3.8.2)軟件,利用Cytoscape的插件CytoHubba通過(guò)Degree算法計(jì)算出Hub基因并排序[10]。

5.核心基因驗(yàn)證:利用免疫熒光染色對(duì)LN及正常對(duì)照腎小球中核心基因表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。LN及正常對(duì)照腎組織切片脫蠟、抗原修復(fù)后利用1%BSA封閉1h。封閉后,切片與抗CASP1、TLR2或MYD88抗體4℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次后,將切片與山羊抗兔IgG-Alexa Fluor488抗體在室溫下孵育1h。再次用PBS洗滌3次后封片。利用Zeiss LSM 800共聚焦顯微鏡觀察并拍攝。

6.免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及相關(guān)性分析:利用R語(yǔ)言及CIBERSORT網(wǎng)站對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的GSE32591基因表達(dá)矩陣進(jìn)行22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析[11]。過(guò)濾掉P>0.05的樣本后利用“vioplot”R包繪制小提琴圖。并利用“psych”R包對(duì)前3位Hub基因表達(dá)情況與免疫細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,同時(shí)使用“ComplexHeatmap”R包繪制相關(guān)性熱圖。

結(jié) 果

1.LN和NC腎小球細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs篩選:在數(shù)據(jù)集GSE32591標(biāo)準(zhǔn)化后篩選出351個(gè)DEGs,其中包含250個(gè)上調(diào)基因,101個(gè)下調(diào)基因(圖1A)。然后,將351個(gè)DEGs與GeneCards網(wǎng)站獲得的156個(gè)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因取交集,篩選出12個(gè)細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs(圖1B),包括CD14、LY96、PYCARD、TLR2、GBP1、CASP1、IFI16、PECAM1、GZMA、MYD88、ACE2和CHI3L1,其中ACE2和CHI3L1為下調(diào)基因,其余為上調(diào)基因。將細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs表達(dá)情況繪制熱圖(圖1C)。

2.細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs的GO富集和KEGG通路分析:將12個(gè)細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs進(jìn)行富集分析。GO富集的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能。細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs主要位于細(xì)胞膜和炎性小體,參與的生物學(xué)過(guò)程主要包括白細(xì)胞介素8的產(chǎn)生及分泌、細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、MyD88依賴(lài)性Toll樣受體信號(hào)通路;分子功能集中在Toll樣受體結(jié)合、信號(hào)模式識(shí)別受體活性、模式識(shí)別受體活性、脂多糖結(jié)合和脂肽結(jié)合(圖2)。KEGG通路分析顯示,細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs主要富集在在軍團(tuán)菌病、百日咳、沙門(mén)菌感染、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路富集(圖2)。

圖2 LN和NC腎小球中細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs的GO富集分析和KEGG通路分析BP.生物學(xué)過(guò)程;CC.細(xì)胞成分;MF.分子功能;KEGG.《京都基因與基因組百科全書(shū)》

3.PPI網(wǎng)絡(luò)和樞紐基因:使用STRING構(gòu)建細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3A),除去不連貫的分子ACE2和CHI3L1,有10個(gè)節(jié)點(diǎn)并形成21個(gè)連接邊。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中,利用CytoHubba模塊degree算法及MCC算法對(duì)10個(gè)節(jié)點(diǎn)基因進(jìn)行排序并繪制網(wǎng)絡(luò)(圖3中B～C),CASP1、TLR2和MYD88為排名前3位的共同核心基因。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)和Hub基因A.STRING構(gòu)建的細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs PPI網(wǎng)絡(luò);B.degree算法基因排序及網(wǎng)絡(luò);C.MCC算法基因排序及網(wǎng)絡(luò)

4.核心基因驗(yàn)證:利用免疫熒光染色對(duì)LN及正常對(duì)照腎小球中核心基因表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,LN腎小球中CASP1、TLR2及MYD88表達(dá)(綠色熒光)均顯著高于正常對(duì)照組(圖4)。

圖4 CASP1、TLR2和MTD88在LN及NC腎小球中表達(dá)情況LN 3例,正常對(duì)照3例,綠色熒光代表CASP1、TLR2及MYD88表達(dá)情況,藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核,共聚焦顯微鏡40倍下拍攝

5.免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析:利用CIBERSORT對(duì)GSE32591數(shù)據(jù)集進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析,按照P<0.05過(guò)濾后數(shù)據(jù)集的5個(gè)NC和30個(gè)LN樣本被納入后續(xù)分析。22種免疫細(xì)胞表達(dá)差異情況繪制小提琴圖(圖5)。與NC組比較,LN腎小球中初始B細(xì)胞(P=0.043)、單核細(xì)胞(P=0.025)表達(dá)升高,而記憶B細(xì)胞(P=0.002)、靜息CD4+記憶T細(xì)胞(P=0.011)、濾泡輔助T細(xì)胞(P=0.007)和靜息NK細(xì)胞(P=0.046)表達(dá)降低。

圖5 LN和NC腎小球免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析綠色.NC組;紅色.LN組;紅框.P<0.05

6.免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與Hub基因相關(guān)性分析:利用Spearman相關(guān)性對(duì)CASP1、TLR2和MYD88與22種免疫細(xì)胞的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析并繪制相關(guān)性熱圖(圖6)。結(jié)果顯示,在LN和NC腎小球中,CASP1、TLR2和MYD88的表達(dá)與有顯著差異的免疫細(xì)胞有明顯相關(guān)性,并與其中的記憶B細(xì)胞、靜息CD4+記憶T細(xì)胞和靜息NK細(xì)胞呈負(fù)相關(guān),與單核細(xì)胞呈正相關(guān)。

圖6 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與Hub基因相關(guān)性分析綠色.負(fù)相關(guān); 紅色.正相關(guān);紅框.LN和NC兩組表達(dá)差異的免疫細(xì)胞(P<0.05);*P<0.05,**P<0.01

討 論

生物信息學(xué)分析可以在極短的時(shí)間內(nèi)處理大量的樣品,并提供與疾病密切相關(guān)的有價(jià)值信息,在最近幾年,利用生物信息學(xué)技術(shù)已發(fā)現(xiàn)了一些與SLE密切相關(guān)的基因與免疫細(xì)胞[12,13]。本研究中,與NC組比較,單核細(xì)胞在LN組腎小球中表達(dá)明顯升高。單核細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,具有抗原呈遞能力并可產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子促進(jìn)SLE的發(fā)生、發(fā)展[14]。在健康小鼠中單核細(xì)胞約占血液白細(xì)胞的4%,而在易患狼瘡的小鼠中占50%以上[15]。在適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子刺激下,靜止的M0巨噬細(xì)胞可極化為M1和M2巨噬細(xì)胞[16]。本研究中M0、M1和M2的表達(dá)沒(méi)有明顯差異。有研究顯示,SLE患者血液中NK細(xì)胞的比例較低,尤其是在LN患者中[17,18]。筆者發(fā)現(xiàn),LN腎小球中靜息NK細(xì)胞下降,與既往研究相符。異常的記憶B細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞均在SLE發(fā)病機(jī)制中起重要作用[19,20]。與NC組比較,LN腎小球中記憶B細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞表達(dá)下降,這些免疫細(xì)胞在LN發(fā)病機(jī)制中的具體作用仍有待于進(jìn)一步闡明。

本研究篩選出CASP1,TLR2和MYD88為細(xì)胞焦亡相關(guān)的核心基因,并通過(guò)免疫熒光驗(yàn)證,在LN腎小球中CASP1、TLR2和MYD88的表達(dá)水平比正常對(duì)照腎小球明顯升高。CASP1,TLR2和MYD88表達(dá)與LN腎小球單核細(xì)胞呈正相關(guān)。NLRP3炎性小體在CASP1激活中起核心作用,導(dǎo)致IL-1β和IL-18活化,并參與LN的發(fā)生、發(fā)展[21]。筆者既往研究也發(fā)現(xiàn),抗dsDNA抗體通過(guò)與TLR4結(jié)合并誘導(dǎo)線粒體ROS的產(chǎn)生,激活SLE患者單核-吞噬細(xì)胞中的NLRP3炎性小體,CASP1表達(dá)升高,參與SLE的發(fā)生、發(fā)展[22]。MYD88作為通用銜接蛋白在調(diào)節(jié)大多數(shù)Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)包括TLR2和IL-1受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及針對(duì)病毒和細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。MYD88在TLR2通路介導(dǎo)鏈球菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥。在SLE中TLR2/MyD88/miR-155/Ets-1通路介導(dǎo)了循環(huán)免疫復(fù)合物的內(nèi)源性配體HMGB1對(duì)抗dsDNA抗體的誘導(dǎo)。TLR2和TLR4在狼瘡小鼠的病情發(fā)展中發(fā)揮作用,與C57BL/6lpr/lpr小鼠比較,TLR2和TLR4缺陷的C57BL/6lpr/lpr小鼠的疾病較輕,免疫學(xué)改變較少,腎臟病變減少,自身抗體低度顯著降低,B淋巴細(xì)胞表型分析顯示邊緣區(qū)B細(xì)胞、促炎性細(xì)胞因子IL-6產(chǎn)生顯著減少。以上均提示CASP1、TLR2和MYD88與免疫細(xì)胞關(guān)系密切,參與了SLE及LN的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述,本研究分析了GSE32591數(shù)據(jù)集NC和LN腎組織活檢樣本中腎小球的基因表達(dá)譜,篩選出351個(gè)DEGs,與細(xì)胞焦亡相關(guān)基因取交集后篩選出12個(gè)細(xì)胞焦亡相關(guān)DEGs,并進(jìn)行了GO和KEGG富集分析、建立PPI網(wǎng)絡(luò)、計(jì)算Hub基因,并進(jìn)行驗(yàn)證。利用CIBERSORT進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析及與Hub基因相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)CASP1、TLR2和MYD88表達(dá)與在LN和NC腎小球中表達(dá)有差異的記憶B細(xì)胞、靜息CD4+T記憶細(xì)胞和靜息NK細(xì)胞呈負(fù)相關(guān),與單核細(xì)胞呈正相關(guān)。這些基因可能在LN中發(fā)揮關(guān)鍵功能,對(duì)這些基因的進(jìn)一步研究可能會(huì)為確定LN免疫治療靶點(diǎn)提供新的思路。