周雅卿 馬 莉 王 力 李維妙 劉偉東 趙永林

一些腫瘤患者在化療期間和化療后出現(xiàn)認(rèn)知能力下降,這種認(rèn)知障礙通常被稱為化療相關(guān)認(rèn)知障礙(chemotherapy-induced cognitive impairment,CICI),也稱化療腦(chemo-brain),主要表現(xiàn)為患者的記憶力衰退,學(xué)習(xí)能力下降,注意力、推理能力及執(zhí)行能力等方面較前減退。在癌癥幸存者中CICI的患病率為14%～85%,最常見的癥狀是記憶力以及注意力較前減退。CICI具有差異性,多數(shù)情況下是短暫且可逆的,但也可以持續(xù)數(shù)年,或有更嚴(yán)重的進(jìn)行性惡化,從而影響患者的生活質(zhì)量[1]。

目前對(duì)于CICI的發(fā)病機(jī)制尚無定論,CICI的發(fā)生可能與化療導(dǎo)致的海馬細(xì)胞損傷、DNA損傷、修復(fù)障礙、炎性反應(yīng)、激素水平變化等有關(guān),且目前國內(nèi)外尚無有關(guān)CICI發(fā)生后腦組織蛋白質(zhì)水平的變化和系統(tǒng)研究。iTRAQ技術(shù)聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜常用于蛋白質(zhì)組定量,可以篩選出差異蛋白。本研究擬應(yīng)用iTRAQ技術(shù)檢測(cè)經(jīng)阿霉素和環(huán)磷酰胺處理后大鼠海馬組織的差異表達(dá)蛋白,有助于揭示CICI的發(fā)生機(jī)制,并尋找其潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及大鼠CICI模型制備:由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供6只具有相同遺傳背景的健康成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量為250～300g,動(dòng)物試驗(yàn)許可證號(hào):SCXK(陜)08-018,西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)已批準(zhǔn)此次實(shí)驗(yàn)倫理。隨機(jī)將6只健康成年雄性SD大鼠分為化療組及對(duì)照組各3只。化療組大鼠尾靜脈注射環(huán)磷酰胺(40mg/kg)和阿霉素(4mg/kg),每周1次,連續(xù)3周;對(duì)照組注射等劑量的0.9% NaCl注射液。

2．取材及樣品制備:末次給藥結(jié)束后1周,腹腔麻醉兩組大鼠后快速開胸,經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈后開始灌注0.9% NaCl注射液,待流出液清亮后迅速取大鼠海馬組織,置于無菌凍存管后,于干冰中凍存運(yùn)輸。

3．蛋白提取、定量質(zhì)檢及質(zhì)譜分析:將組織解凍后加適量含EDTA的Cocktail,置于冰上5min,加入終濃度為10mmol/L的DTT后裂解,離心后取上清,加入10mmol/L的DTT,56℃中水浴1h。加入IAM(55mmol/L)后避光靜置45min,離心后取上清。考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白濃度,采用SDS-PAGE電泳法評(píng)估樣品質(zhì)量。取100μg蛋白液加入到1.5ml離心管中,37℃酶解4h。對(duì)肽段消化后除鹽并冷凍抽干,用TEAB溶解肽段樣品后對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記及分離后冷凍抽干,用流動(dòng)相A復(fù)溶肽段后離心取上清。使用美國Thermo公司UltiMate 3000 UHPLC進(jìn)行分離。將液相分離后的肽段通過nanoESI源離子化后進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行DDA模式檢測(cè)。

4.生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì):將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成MGF格式后經(jīng)Mascot軟件和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫比對(duì)搜索得到的蛋白鑒定結(jié)果。同時(shí)進(jìn)行質(zhì)控分析,并對(duì)所得蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果進(jìn)行篩選。隨后經(jīng)iTRAQ定量分析篩選顯著差異蛋白,通過超幾何檢驗(yàn)對(duì)差異蛋白進(jìn)行富集分析。利用STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行互作分析,繪制網(wǎng)絡(luò)互作圖。

結(jié) 果

1.差異蛋白鑒定及定量分析:利用Mascot2.3.02軟件在Rattus_norvegicus數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白鑒定和分析,共鑒定出52764 條肽段和7670個(gè)蛋白,進(jìn)行iTRAQ定量分析,以iTRAQ比值>1.2和P<0.05兩個(gè)條件篩選,共鑒定出434種差異蛋白,與對(duì)照組比較,化療組上調(diào)338種蛋白,下調(diào)96種蛋白(圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異蛋白火山圖

2.差異蛋白生物信息學(xué)分析:通過顯著差異蛋白和作為背景的全體鑒定蛋白比較,利用超幾何檢驗(yàn)(P<0.05)找出顯著富集的GO條目,依據(jù)相關(guān)生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能對(duì)化療組與對(duì)照組的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO分類富集,結(jié)果顯示差異蛋白主要富集于細(xì)胞組分、細(xì)胞器、細(xì)胞膜等細(xì)胞成分;參與細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程等生物學(xué)過程;顯著富集于結(jié)合、催化、調(diào)節(jié)等分子功能(P<0.05),詳見圖2。

圖2 差異蛋白GO富集分析

3.差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集分析結(jié)果:對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析,結(jié)果顯示其主要富集的通路有單純皰疹病毒感染、免疫排斥、自身免疫性甲狀腺疾病等,詳見圖3。

圖3 差異蛋白KEGG通路富集氣泡圖

4.差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析:對(duì)化療組和對(duì)照組的差異蛋白進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要與免疫相關(guān),與KEGG通路富集分析一致,其中信號(hào)>轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)及泛素樣修飾劑ISG15連接度較高。

討 論

在過去幾十年中,由于認(rèn)為化療藥物不會(huì)通過血-腦脊液屏障損傷大腦以及對(duì)化療后患者后續(xù)隨訪的缺失,導(dǎo)致研究者忽視了CICI這一化療常見不良反應(yīng)。隨著長期癌癥幸存者人數(shù)的逐年增加及對(duì)化療不良反應(yīng)的深入探究,CICI受到了越來越多的關(guān)注。目前對(duì)CICI的認(rèn)定依靠于標(biāo)準(zhǔn)化的神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試、電生理及神經(jīng)影像技術(shù)等,對(duì)于CICI的診斷仍缺乏客觀、有效的指標(biāo)。另外,有關(guān)CICI 的機(jī)制還尚不明確,基于目前的研究其可能機(jī)制包括直接的神經(jīng)毒性作用、血-腦脊液屏障的破壞、海馬功能障礙、神經(jīng)元增殖破壞、繼發(fā)性炎性反應(yīng)、白質(zhì)異常、氧化應(yīng)激增加和腦血流改變等[3]。

本研究擬通過iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)潛在的靶點(diǎn)蛋白,為CICI機(jī)制的研究及篩選可能的生物學(xué)標(biāo)志物提供相關(guān)科研依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)共篩選出434種差異蛋白,其中上調(diào)的差異蛋白有338種,下調(diào)的有96種,對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO 功能富集分析,結(jié)果顯示差異蛋白主要富集于細(xì)胞器、細(xì)胞膜等細(xì)胞成分;主要參與細(xì)胞代謝過程、生物調(diào)節(jié)及代謝過程等生物學(xué)過程;顯著富集于結(jié)合、催化等分子功能。對(duì)差異蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析顯示其主要富集于單純皰疹病毒感染、免疫排斥、自身免疫性甲狀腺疾病等與免疫相關(guān)的通路。通過構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及STAT及泛素樣修飾劑ISG15處于中心位置,均與免疫相關(guān),與KEGG通路富集分析結(jié)果一致。

聯(lián)合使用阿霉素和環(huán)磷酰胺被廣泛用于腫瘤患者的輔助化療,盡管阿霉素及其主要代謝物均未穿過血-腦脊液屏障,但仍會(huì)導(dǎo)致腦損傷,可能的機(jī)制包括氧化應(yīng)激增加、促炎性細(xì)胞因子水平升高、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平升高和線粒體功能障礙[4～7]。輕松穿過血-腦脊液屏障或通過腦室器官進(jìn)入大腦的促炎性細(xì)胞因子可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞,加劇損傷部位促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后活化巨噬細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子,在神經(jīng)炎癥中有至關(guān)重要的作用[8]。此外,即使不進(jìn)入大腦,促炎性細(xì)胞因子也可以通過破壞血-腦脊液屏障的微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接,增加其通透性[9]。在結(jié)果中IFN-γ顯著上調(diào),IFN-γ廣泛參與先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。Shechter等[10]研究發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷后,單核細(xì)胞歸巢于受損組織分為兩個(gè)階段。第一階段,受損組織周圍軟腦膜可協(xié)助循環(huán)單核細(xì)胞集中于受損組織成為具有促炎作用的M1型巨噬細(xì)胞,IFN-γ參與M1型巨噬細(xì)胞的活化。第二階段,脈絡(luò)從可通過調(diào)節(jié) IFN-γ/IFN-γR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)協(xié)調(diào)單核細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)成為具有抗炎作用的M2型巨噬細(xì)胞,決定了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的免疫監(jiān)視及損傷恢復(fù)[10,11]。神經(jīng)炎癥是CICI可能機(jī)制之一,通過調(diào)控IFN-γ或控制單核細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而減輕神經(jīng)炎癥有望改善CICI。

JAK/STAT通路在先天性免疫和獲得性免疫的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用,JAK/STAT途徑的異常激活在多發(fā)性硬化癥和帕金森病等神經(jīng)炎性疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要作用[12]。細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合,使受體亞基多聚化誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)激活,激活的JAKs磷酸化酪氨酸殘基與STAT對(duì)接,致使STAT磷酸化形成二聚體,二聚化的STAT從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核中,通過與特異性DNA元件結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞因子反應(yīng)基因的表達(dá)[13]。本研究結(jié)果顯示,在JAK/STAT通路中,上調(diào)的細(xì)胞因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子激活JAK/STAT通路,二聚化的STAT進(jìn)入細(xì)胞核后使AOX表達(dá)上調(diào),AOX通過調(diào)控脂質(zhì)代謝影響細(xì)胞周期。但JAK/STAT通路作用機(jī)制十分復(fù)雜,需進(jìn)一步研究確定其對(duì)CICI的影響。

下調(diào)的差異蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶使絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1磷酸化抑制前體mRNA選擇性剪接,提示可能與CICI有關(guān),但需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

目前對(duì)于CICI的機(jī)制還缺乏明確及清晰的認(rèn)識(shí),本研究利用iTRAQ技術(shù)篩選與CICI有關(guān)的通路及蛋白。結(jié)果進(jìn)一步說明CICI與神經(jīng)炎癥有關(guān),尤其是CICI與自身免疫的相關(guān)性值得進(jìn)一步研究。細(xì)胞因子,特別是IFN-γ可能是CICI潛在的生物學(xué)標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。本研究為后續(xù)CICI機(jī)制的探究提供了一定的方向及依據(jù),希望在此基礎(chǔ)上有更深層次的研究揭示CICI的發(fā)病機(jī)制,為緩解及治療CICI帶來新希望。