楊永濤 殷裕雄 張浩強 耿智隆

腎臟是失血性休克及復蘇期間最易受損傷的器官之一,休克后腎臟微循環(huán)灌注不足引起細胞代謝功能障礙,產(chǎn)生氧化應激及炎性反應導致腎損傷,因此腎臟需及時恢復正常組織灌注才可減輕損傷,然而休克早期液體復蘇在高原患者的承受能力較低,即使輸入遠較平原地區(qū)正常用量少的液體也易誘發(fā)肺水腫和腦水腫[1]。當液體復蘇后腎灌注急劇增加,腎臟缺血再灌注加重炎性反應和氧化應激,進一步加重腎組織結構功能的損傷。然而腎損傷機制尚不明確仍無有效治療策略,而腎損傷相關機制與NLRP3(nod-like receptor protein-3)炎性小體的關系受到臨床研究的重視。研究表明,NLRP3炎性小體及NLRP3炎性小體活化標記因子半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)作為抑制炎性反應的核心調節(jié)受體,對腎損傷具有重要的保護作用[2]。研究表明,通過抑制NLRP3-caspase-1可改善氧化應激和炎性反應,進而緩解缺血再灌注導致的腎小管細胞死亡及腎小管結構和功能損傷,明顯改善腎功能[3]。研究表明,藏紅花素具有抗炎和抗氧化應激作用,藏紅花素可抑制失血性休克后腎臟的氧化應激和炎性反應[4～6]。然而這種保護作用是否通過抑制NLRP3炎性小體尚未明確。

本研究擬建立急進高原狀態(tài)下重度失血性休克模型,闡明藏紅花素治療休克后腎損傷可能的調節(jié)機制,并進一步明確NLRP3炎性小體及NLRP3炎性小體活化標記因子caspase-1在這種調節(jié)作用中的保護機制,為臨床合理用藥提供參考。

材料與方法

1.實驗動物及主要試劑:SPF級SD雄性大鼠30只,鼠齡12～15周,體質量為200～250g,購自重慶滕鑫生物技術有限公司,動物試驗許可證號:SCXK(遼)020——001。24h內(nèi)將大鼠由甘肅省蘭州市(海拔1503米)運往青海玉樹(海拔4010米)。12h晝夜循環(huán),室溫25℃左右,提供食物和水。本實驗通過中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院動物倫理委員會審批(倫理學審批號:2021KYLL121)。藏紅花素購自上海源葉生物科技有限公司(純度≥98%,批號:YY90210)。SCR、BUN、NLRP3、caspase-1、IL-18及IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海江萊實業(yè)有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,anti-NLRP3、anti-caspase-1均購自北京索萊寶科技有限公司。

2.動物分組、模型建立及藥物治療:大鼠禁食8h,自由飲水,采用隨機數(shù)字表法分為5組(n=6),即C組、NACL組、LC組、MC組和HC組。腹腔注射10%水合氯醛(3ml/100g)麻醉,采用Wigger′s改良法制備急進高原重度失血性休克大鼠模型,大鼠右側頸部備皮、消毒、分離皮下組織后暴露出頸動脈和頸靜脈,用24G留置針對頸動脈及頸靜脈置管,導管用肝素0.9%氯化鈉溶液預先肝素化,動脈導管連接多通道生理檢測儀的壓力傳感器監(jiān)測平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP),將血氧探頭置于鼠尾監(jiān)測血氧飽和度(peripheral capillary oxygen saturation,SpO2)[7]。按照0.5U/g全身肝素化處理,大鼠生命體征維持10min后。經(jīng)頸動脈勻速放血30min,使MAP降低至35mmHg,放出血液給予7.5U/ml肝素抗凝處理后保存。給大鼠放血或血液回輸將MAP維持在30～40mmHg,維持時間為60min。操作全程將大鼠置于恒溫37℃工作臺上。大量研究表明,使用10～80mg/kg藏紅花素對失血性休克或缺血誘導的多器官損傷具有保護作用[5,8,9]。根據(jù)文獻報道,選擇40、60、80mg/kg藏紅花素作為本研究中的使用劑量。模型制備成功即刻進行藥物復蘇,LC組、MC組、HC組分別腹腔注射40、60、80mg/kg藏紅花素,NACL組給予相同容量的0.9%氯化鈉溶液,C組僅置管不放血。

3.指標檢測:記錄大鼠休克前、休克后(復蘇時)、復蘇0.5h、復蘇1h、復蘇2h、復蘇3h及大鼠未存活3h死亡前MAP及SPO2,藥物復蘇3h后或大鼠死亡即刻(生存時間不足3h)處死大鼠取心臟血液1ml離心后取血清-20℃保存及腎臟組織-80℃冷凍保存,取血清采用ELISA法測定SCR、BUN。取部分腎組織采用ELISA法測定NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β,上述均嚴格按照試劑盒說明進行操作。

4.Western blot法檢測:取凍存腎組織50mg,加組織細胞裂解液200μl勻漿,提取蛋白,BCA法蛋白定量,10%SDS-PAGE分離各組蛋白并轉移至PVDF膜,封閉液室溫封閉2h。滴加一抗,4℃過夜孵育。洗膜后37℃孵育HRP標記山羊抗兔IgG二抗1h。洗膜后化學發(fā)光、顯影,凝膠成像分析系統(tǒng)行灰度掃描分析,結果以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度比值表示。

結 果

1.大鼠生存情況:C組大鼠3h無死亡,NACL組和LC組大鼠3h生存率為0,MC組大鼠3h生存率為16.67%,HC組大鼠3h生存率為33.33%。與NACL組比較,MC組、HC組、C組的生存時間及生存率明顯高于NACL組(P<0.05);與C組比較,NACL組、LC組、MC組、HC組的生存時間及生存率明顯低于C組(P<0.05),經(jīng)藏紅花素干預后呈劑量依賴性延長大鼠存活時間,詳見表1及圖1。

圖1 大鼠3h生存曲線圖

表1 大鼠生存時間比較

2.大鼠不同時間點MAP變化:與C組比較,NACL組、LC組、MC組、HC組休克后(復蘇時)、復蘇0.5h、復蘇1h的MAP均低于C組(P<0.05),詳見表2。

表2 大鼠不同時間點MAP變化

3.大鼠不同時間點SpO2變化:各組大鼠在休克前SpO2并無差異;與NACL組比較,MC組、HC組、C組在復蘇0.5h、復蘇1h的SpO2均升高(P<0.05);與C組比較,NACL組、LC組、MC組、HC組的SpO2在休克后(復蘇時)、復蘇0.5h、復蘇1h均下降(P<0.05),詳見表3。

表3 大鼠不同時間點SpO2變化

4.大鼠腎臟功能:ELISA實驗結果表明NACL組血清中SCR、BUN水平高于LC組、MC組、HC組、C組(P<0.05);C組大鼠SCR、BUN含量低于HC組(P>0.05),且明顯低于NACL組、LC組及MC組(P<0.01);經(jīng)藏紅花素干預后SCR、BUN水平在LC組、MC組、HC組呈劑量依賴性降低(P<0.05),詳見圖2。

5.大鼠炎性細胞因子水平:ELISA實驗結果表明,NACL組大鼠腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β顯著高于LC組、MC組、HC組、C組(P<0.05);C組大鼠NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β低于HC組(P>0.05),且明顯低于NACL組、LC組及MC組(P<0.01);經(jīng)藏紅花素干預后LC組、MC組、HC組腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β的水平呈劑量依賴性降低(P<0.05),詳見圖3。

圖3 大鼠炎性細胞因子變化與NACL組比較,*P<0.05,**P<0.01;與C組比較,#P<0.01;與LC組比較,ΔP<0.01

6.大鼠腎組織NLRP3及caspase-1蛋白表達情況:Western blot法結果表明,NACL組腎組織中NLRP3及caspase-1蛋白含量高于LC組、MC組、HC組及C組(P<0.05);經(jīng)藏紅花素干預后LC組、MC組、HC組腎組織中NLRP3及caspase-1蛋白含量呈劑量依賴性降低,藏紅花素可抑制NLRP3炎性小體及NLRP3炎性小體活化標記因子caspase-1的活化,詳見圖4及圖5。

圖4 大鼠腎組織NLRP3及caspase-1蛋白表達

圖5 大鼠腎組織NLRP3及caspase-1相對含量與NACL組比較,*P<0.05,**P<0.01;與C組比較,#P<0.01;與LC組比較,ΔP<0.01

討 論

失血性休克可引起一系列復雜的病理生理過程,其發(fā)病與微循環(huán)、氧代謝、炎癥、免疫及凝血等有關,引起機體生理異常,進一步導致各器官衰竭或死亡[10]。本實驗地點海拔為4120米,隨著海拔升高氧分壓減少約31mmHg,大氣中氧含量相當于海拔1503米氧含量的75%。與平原地區(qū)比較,高原地區(qū)經(jīng)歷相同的失血,其休克嚴重程度也不同。本實驗采用等壓法制備失血性休克模型,本實驗組前期研究發(fā)現(xiàn)制備等容失血性休克模型時平原地區(qū)大鼠致死失血量約為其全身血量的60%,在急進高原狀態(tài)下大鼠致死失血量約為其全身血量的55%。急性腎損傷在急進高原重度失血性休克后引起的多器官衰竭的發(fā)展過程中是常見且嚴重的,并且與危重患者病死率增加有關,因此減輕腎損傷的相關復蘇策略可能會改善休克引起的不良后果。在高原低氧、低壓、寒冷的特殊地理環(huán)境下,經(jīng)歷失血性休克和急進高原雙重打擊后會加重組織缺血缺氧和炎性反應導致細胞因子、炎性介質和氧化因子迅速產(chǎn)生并大量釋放[11]。

NLRP3炎性小體在炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。而缺血再灌注損傷、氧化應激等多種因素均可激活NLRP3炎性小體[12]。NLRP3炎性小體被激活后使得半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)前體自身酶解成具有生物活性的caspase-1,caspase-1活化后使得pro-IL-1β和pro-IL-18加工成具有生物活性的IL-1β和IL-18進而發(fā)揮相應生理作用[13]。NLRP3作為炎性細胞因子的啟動因子,可活化細胞因子前體使其自發(fā)激活,釋放炎性介質和細胞因子,引起休克后多臟器損傷[14]。研究表明,在急性腎小管壞死相關的腎缺血再灌注損傷小鼠模型中NLRP3和凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)的表達上調[15]。而NLRP3、ASC和caspase-1缺陷的動物不受腎臟炎癥的影響[16]。在IL-18缺失的小鼠腎功能及腎小管損傷程度更低,當用IL-18拮抗劑預處理小鼠時也有類似結果[17]。NLRP3基因缺失的小鼠在缺血再灌注損傷后表現(xiàn)出抑制腎小管壞死和凋亡以及促進腎小管上皮細胞增殖[18]。在小鼠腎臟缺血再灌注3天后NLRP3炎性小體激活達到峰值,而NLRP3基因敲除小鼠對缺血性急性腎損傷有保護作用。敲除NLRP3基因或加入caspase-1抑制劑可顯著降低ASC、caspase-3、IL-1β及IL-18表達水平,同時逆轉CLP小鼠的腎臟損傷,證明NLRP3與caspase-1參與膿毒癥誘發(fā)的急性腎損傷[19]。因此以上研究表明,NLRP3炎性小體信號通路可能參與休克引起腎損傷的過程,所以抑制NLRP3炎性小體活化可以改善失血性休克后腎臟炎性反應。

本實驗中藏紅花素組腎功能指標、炎性細胞因子及蛋白表達呈劑量依賴性降低,可提高大鼠的生存率及生存時間,證明NLRP3及NLRP3炎性小體活化的標記因子caspase-1可能參與了急進高原失血性休克大鼠早期腎損傷的過程,表明藏紅花素抑制NLRP3炎性小體可能是急進高原失血性休克大鼠腎臟損傷的保護機制。所以NLRP3炎性小體可作為急進高原失血性休克腎損傷的治療靶點。

綜上所述,藏紅花素具有抗氧化應激、抗炎、抗組胺、改善焦慮和抑郁、催眠、改善腦代謝、調節(jié)血脂、抗腫瘤、免疫調節(jié)等作用[4]。在休克后腎保護方面可明顯抑制NLRP3炎性小體相關的信號通路活化,并改善腎功能,提高休克大鼠生存率。所以藏紅花素通過NLRP3炎性小體相關信號通路來介導失血性休克后腎損傷的發(fā)生、發(fā)展,并起到明顯的保護作用。本研究為臨床上治療急進高原地區(qū)休克后腎臟損傷提供了新的治療靶點和臨床策略。