李秀翠 張子龍 李 軒 馬伊璇 李慧敏 薛銘杰 洪靜怡 蔡曉紅

兒童阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hyponea syndrome,OSAHS)是一種常見的睡眠障礙疾病,主要表現(xiàn)為睡眠過程中反復(fù)出現(xiàn)上呼吸道阻塞,導(dǎo)致反復(fù)呼吸暫停、低通氣及睡眠覺醒,破壞兒童睡眠中正常通氣和睡眠結(jié)構(gòu),影響病理生理過程。OSAHS可引起兒童學(xué)習(xí)記憶等多方面的障礙,夜間反復(fù)發(fā)生的慢性間歇低氧(intermittent hypoxia,CIH)對缺氧敏感區(qū)腦組織的損害,可能是其病理基礎(chǔ)[1]。目前OSAHS導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的具體機(jī)制尚不明確。

腺苷是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)和ATP降解的產(chǎn)物,在缺血缺氧、應(yīng)激等條件下,通過作用于G蛋白偶聯(lián)受體亞型(包括A1、A2A、A2B和A3)對機(jī)體進(jìn)行調(diào)節(jié)。A2A受體(A2Areceptor,A2AR)可在海馬、皮質(zhì)、紋狀體中表達(dá),主要調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸可塑性和神經(jīng)元興奮性,以控制學(xué)習(xí)和記憶[2, 3]。A2AR已被證明在認(rèn)知功能障礙患者以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的動物模型中表達(dá)增加,表明A2AR與認(rèn)知障礙相關(guān)[4]。然而,迄今為止,A2AR 在OSAHS認(rèn)知損害中的作用仍然未知。

突觸可塑性是神經(jīng)元對刺激發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能的改變,目前普遍認(rèn)為突觸可塑性與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)[5]。A2AR可以整合傳入信息以控制突觸可塑性和神經(jīng)傳導(dǎo)[6]。長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)是突觸可塑性重要的表現(xiàn)形式之一,是目前研究學(xué)習(xí)記憶最重要的分子細(xì)胞模型。阻斷A2AR可降低海馬突觸的LTP,激活海馬A2AR促進(jìn)CA1錐體神經(jīng)元中的LTP[4,7]。突觸融合蛋白syntaxin,是突觸小泡和突觸前膜融合所必需的,參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放。既往研究證明,A2AR可降低海馬神經(jīng)元syntaxin密度,從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶損害,A2AR非特異性抑制劑咖啡因干預(yù)后可減輕海馬神經(jīng)元損傷誘導(dǎo)的syntaxin密度的降低[8,9]。這些研究表明,A2AR在調(diào)節(jié)突觸可塑性和神經(jīng)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究表明,A2AR參與CIH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的過程,筆者推測A2AR在CIH誘導(dǎo)的記憶障礙中至關(guān)重要[10]。因此,本研究在前期建立CIH幼鼠模型的基礎(chǔ)上,揭示腺苷A2AR受體在CIH幼鼠學(xué)習(xí)記憶損害中的作用,進(jìn)而闡明OSAHS兒童學(xué)習(xí)記憶損害的機(jī)制。

材料與方法

1.主要試劑及儀器:尼氏染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),鼠抗鼠單克隆抗體Syntaxin(英國Abcam公司),BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce Biotechnology公司),膜片鉗,CIH模擬艙及八臂迷宮(溫州醫(yī)科大學(xué)科研中心)。

2.實(shí)驗(yàn)動物分組:清潔級健康雄性C57BL/6小鼠,4周齡,體質(zhì)量為18～22g,共36只,購自溫州醫(yī)科大學(xué) (許可證號:SCXK 2018-0017)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、空氣模擬對照組、慢性間歇低氧模型組(模型組)、模型組+A2AR激動劑CGS21680組(A2AR激動劑組)、模型組+A2AR抑制劑SCH5826組(A2AR抑制劑組)、模型組+DMSO溶劑對照組(溶劑對照組),每組6只。取基因鑒定成功后的A2AR基因敲除型A2AR(-/-) 4周齡C57BL/6小鼠10只,按隨機(jī)數(shù)字表法取出其中6只為模型組+A2AR基因敲除組(A2AR敲除組)。所有實(shí)驗(yàn)操作過程遵循實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號:wydw 2021-0628)。

3.動物模型制備:按照參考文獻(xiàn)[11]的方法,建立OSAHS慢性間歇性低氧動物模型。艙內(nèi)低氧時(shí)氧濃度為10.0%±1.5%,復(fù)氧時(shí)氧濃度為21.0%±0.5%,CO2濃度<0.01%,每天7h(8:00～15:00時(shí)),每周7天,共4周。將模型組、A2AR激動劑組、A2AR抑制劑組、A2AR敲除組及溶劑對照組置于氧艙中,空氣模擬對照組置于空氣模擬對照艙中,空白對照組在同一室內(nèi)氧艙外飼養(yǎng)。A2AR激動劑組、A2AR抑制劑組、溶劑對照組每天進(jìn)氧艙前30min分別腹腔注射15μl/(g·d) 的CGS21680(0.1mg/kg)、SCH58261(1mg/kg)、0.1% DMSO溶液[12,13]。

4.實(shí)驗(yàn)方法:(1)八臂迷宮行為學(xué)檢測:參照參考文獻(xiàn)[11]的方法,對小鼠進(jìn)行八臂迷宮訓(xùn)練,迷宮訓(xùn)練于造模結(jié)束前7天開始,每日造模結(jié)束后進(jìn)行訓(xùn)練,每天1次。造模結(jié)束當(dāng)天對小鼠行八臂迷宮行為學(xué)測試。記錄工作記憶錯誤:動物再次進(jìn)入已經(jīng)吃過食物的臂的次數(shù);參考記憶錯誤:小鼠進(jìn)入未曾放過食物的臂的次數(shù);總記憶錯誤:小鼠進(jìn)入放有食物的臂并且吃掉臂中的食物認(rèn)為是正確選擇,否則為錯誤選擇。(2)取材:八臂迷宮測試結(jié)束后,采用2%戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉小鼠,迅速斷頭,將鼠頭置于預(yù)充混合氣(95%O2/5%CO2)的4℃預(yù)冷切片液中,剝離顱骨后,于冰上快速分離鼠腦左右海馬組織,左側(cè)海馬置于液氮中保存或4%多聚甲醛浸泡,待Western blot法檢測蛋白表達(dá)及尼氏染色。右側(cè)海馬進(jìn)行電生理LTP檢測。(3)尼氏染色:取材后用4%的多聚甲醛固定海馬組織24h,依次經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚度5μm),然后按照尼氏染色說明書進(jìn)行操作,最后在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元中尼氏小體數(shù)量及染色變化,評估海馬神經(jīng)元的功能。(4)海馬LTP 檢測:利用震動切片機(jī)將含海馬的腦組織切成300μm厚度的腦片,置于尼龍網(wǎng)上,放入人工腦脊液中,置入恒溫箱中孵育(34℃,1h)。孵育結(jié)束后將腦片移至記錄浴槽,用氧飽和的人工腦脊液持續(xù)灌流(2ml/min),記錄海馬CA3-CA1 區(qū)LTP。先給予測試脈沖,待基線穩(wěn)定后,記錄刺激Schaffer側(cè)枝誘發(fā)的CA1錐體細(xì)胞層的場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP),約30min,然后順次給予間隔 20s 的4次高頻刺激(high frequency stimulation,HFS)刺激。HFS 刺激后繼續(xù)給予刺激前的測試脈沖刺激,并記錄fEPSP 1h以上。將斜率作為評價(jià)fEPSP強(qiáng)度的指標(biāo),并將刺激前的fEPSP斜率設(shè)為100%,用其標(biāo)準(zhǔn)化HFS刺激后的fEPSP斜率,分析最后10min的fEPSP。(5) Western blot法檢測海馬組織中突觸融合蛋白syntaxin蛋白含量:各組幼鼠右側(cè)海馬組織采用RIPA緩沖液裂解,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法檢測蛋白含量。取30μg蛋白上樣,經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,5%牛血清白蛋白室溫封閉2h,一抗4℃孵育過夜,二抗室溫下孵育2h,ECL顯影,Gel-Pro凝膠分析軟件分析,以目的蛋白條帶與內(nèi)參(tublin)條帶累積光密度(IOD)之比作為反映蛋白表達(dá)水平的相對指標(biāo)。一抗syntaxin稀釋度為1∶1000,tublin單克隆抗體稀釋度為1∶1000。

結(jié) 果

1.間歇低氧對各組幼鼠空間記憶的影響:八臂迷宮測試結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組工作記憶錯誤、參考記憶錯誤、總記憶錯誤數(shù)均明顯升高(P<0.01);與模型組比較,A2AR抑制劑組、A2AR敲除組上述3種記憶錯誤數(shù)均明顯減少(P<0.05),A2AR激動劑組記憶錯誤數(shù)均增多(P<0.01),對照組與空氣模擬對照組,溶劑對照組與模型組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1)。

圖1 各組幼鼠工作記憶錯誤、參考記憶錯誤、總記憶錯誤(n=6)與對照組比較,* P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.各組幼鼠海馬尼氏小體的變化:海馬CA1區(qū)尼氏染色的結(jié)果顯示,光鏡下,對照組、空氣模擬對照組海馬神經(jīng)元排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰,尼氏小體數(shù)量豐富,分布均勻,染色呈藍(lán)紫色。模型組海馬神經(jīng)元排列欠規(guī)則,細(xì)胞周圍間隙增寬,細(xì)胞輕度腫脹,與對照組比較,尼氏小體數(shù)量減少,染色變淺。A2AR抑制劑組、A2AR敲除組神經(jīng)元排列好轉(zhuǎn),胞體腫脹水腫減輕,與模型組比較,尼氏小體數(shù)量減少得以改善。A2AR激動劑組可見大量皺縮的神經(jīng)元細(xì)胞,胞體腫脹加重,并出現(xiàn)空泡化,與模型組比較,尼氏小體減少,染色變淺。溶劑對照組與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 各組幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元活性(尼氏小體)的變化(n=6,×400)與對照組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

3.各組幼鼠海馬LTP檢測結(jié)果:各組小鼠海馬腦片CA3-CA1區(qū)LTP檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠腦片海馬CA3-CA1 區(qū)LTP斜率下降(P<0.01);對照組與空氣模擬對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,A2AR抑制劑組、A2AR敲除組LTP斜率升高(P<0.05),而A2AR激動劑組LTP斜率降低(P<0.05);溶劑對照組與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見圖3、表1。

表1 小鼠海馬 CA3-CA1區(qū)

圖3 各組小鼠海馬CA3-CA1區(qū)LTPA.對照組;B.空氣模擬對照組;C.模型組;D.溶劑對照組;E.A2AR激動劑組;F.A2AR抑制劑組;G.A2AR敲除組

4.Western blot法檢測各組幼鼠海馬syntaxin蛋白水平:與對照組比較,模型組syntaxin蛋白表達(dá)水平下降(P<0.01),對照組與空氣模擬對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,A2AR抑制劑組、A2AR敲除組syntaxin表達(dá)升高(P<0.05),A2AR激動劑組syntaxin表達(dá)降低(P<0.05),溶劑對照組與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見圖4。

圖4 各組幼鼠syntaxin蛋白表達(dá)水平變化與對照組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05

討 論

慢性間歇低氧是一種特殊的低氧模式,低氧與常氧交替出現(xiàn),機(jī)體對間歇低氧較持續(xù)低氧難以適應(yīng),損害更為嚴(yán)重。既往研究結(jié)果表明,CIH在OSAHS學(xué)習(xí)記憶障礙中發(fā)揮了重要作用[14]。八臂迷宮測試是研究小鼠學(xué)習(xí)記憶的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法,廣泛用于學(xué)習(xí)記憶功能評價(jià)。本實(shí)驗(yàn)通過八臂迷宮測試發(fā)現(xiàn)間歇性低氧組幼鼠工作記憶、參考記憶錯誤和總錯誤數(shù)明顯多于正常組,提示CIH可損害幼鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

腺苷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì),大腦在缺血缺氧等損傷后腺苷迅速升高并激活相應(yīng)的腺苷受體。其中A2AR表達(dá)于神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞中,在調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸可塑性以及認(rèn)知功能方面發(fā)揮重要作用。課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí),中重度組OSAHS兒童晨起血漿腺苷濃度升高[15]。有研究者提出選擇性激動A2AR可損害記憶,而拮抗A2AR則可改善學(xué)習(xí)記憶,以上研究表明,A2AR與學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控有關(guān)[16]。本研究通過建立A2AR激動、抑制、基因敲除小鼠模型,發(fā)現(xiàn)選擇性拮抗A2AR的小鼠和A2AR基因敲除小鼠,工作記憶錯誤和參考記憶錯誤較間歇低氧組小鼠減少,相反,A2AR激動劑組小鼠錯誤次數(shù)較間歇低氧組明顯增多,提示A2AR的激活加重認(rèn)知功能損傷,而阻滯A2AR起保護(hù)作用。

學(xué)習(xí)和記憶是大腦的高級功能活動,其神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)是神經(jīng)元突觸可塑性,突觸可塑性反映信息儲存過程,LTP是其表現(xiàn)形式之一。腺苷A2AR參與了LTP的誘導(dǎo)和維持,目前普遍認(rèn)為A2AR調(diào)節(jié)突觸可塑性可能是其調(diào)控學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制之一[17]。在電生理研究中,fEPSP是LTP的重要參數(shù),可反映參與興奮的突觸數(shù)量,fEPSP斜率反映了突觸對刺激的響應(yīng)速度,而fEPSP斜率增加表明突觸傳遞增強(qiáng)。因此,對小鼠海馬組織進(jìn)行LTP檢測,能較好地反映小鼠的學(xué)習(xí)記憶情況。此外,突觸可塑性與突觸中釋放的神經(jīng)遞質(zhì)數(shù)量的變化有關(guān),syntaxin作為突觸前膜中的一種整合蛋白質(zhì),誘導(dǎo)突觸小泡與靶膜融合,與突觸小泡停靠到突觸前膜及遞質(zhì)釋放密切相關(guān)。Mishima等[18]研究發(fā)現(xiàn),syntaxin基因敲除的小鼠,其神經(jīng)傳導(dǎo)及海馬CA1區(qū)LTP受損,說明syntaxin是突觸傳遞、突觸可塑性所必需的。因此,通過檢測syntaxin蛋白的表達(dá),可以反映突觸傳遞及可塑性的改變。

本研究通過電生理記錄小鼠海馬CA3-CA1區(qū)LTP及免疫印跡法檢測各組小鼠海馬syntaxin蛋白的表達(dá)量,結(jié)果表明,CIH下調(diào)syntaxin蛋白表達(dá),抑制LTP,表明CIH可致突觸可塑性降低,損害學(xué)習(xí)記憶功能,A2AR激活進(jìn)一步降低突觸可塑性,加重學(xué)習(xí)記憶損傷,而拮抗或敲除A2AR通過上調(diào)syntaxin 蛋白表達(dá),提高LTP,增加突觸可塑性,對學(xué)習(xí)記憶起保護(hù)作用,這與Silva等[8]的研究是一致的。研究表明,海馬A2AR的激活通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)突觸可塑性,包括突觸后N-甲基-D-天冬氨酸受體、紅藻酸受體、含有谷氨酸受體1的AMPA受體,以及腦源性生長因子介導(dǎo)的LTP[7,17]。因此,A2AR在CIH條件下調(diào)控突觸可塑性的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究證明了在CIH幼鼠模型中,腺苷A2AR的激活引起突觸功能障礙,加重小鼠學(xué)習(xí)記憶損害,而拮抗或者敲除A2AR可提高突觸蛋白syntaxin的表達(dá),促進(jìn)LTP,改善學(xué)習(xí)記憶。由此推測,抑制A2AR的活性可能對OSAHS有潛在治療效果,目前臨床上非選擇性A2AR拮抗劑如咖啡因和茶堿已被應(yīng)用于一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的輔助治療。因此,深入研究腺苷A2AR與兒童OSAHS學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系,有利于為兒童OSAHS的防治提供新的思路。