焦琳,殷春霞,夏琦,曹麗芬,余萬(wàn)霖,鄧時(shí)貴

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510006; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510006

順鉑是一線抗癌藥物,具有廣譜療效顯著、性價(jià)比高的優(yōu)勢(shì),但腎毒副作用嚴(yán)重,且呈劑量依賴性,據(jù)報(bào)道,大約有20%～30%的患者在使用順鉑化療后會(huì)出現(xiàn)不同程度的腎臟功能下降,因此臨床應(yīng)用受限[1-2]。為解決此問(wèn)題,臨床上常采用水化利尿法或調(diào)節(jié)順鉑給藥方式治療,雖顯現(xiàn)出了一定的腎臟保護(hù)作用,但效果有限,并存在遠(yuǎn)期療效差、藥品價(jià)格高等缺點(diǎn)[3];同時(shí),大量補(bǔ)液會(huì)對(duì)患者不利,也給臨床工作帶來(lái)不便,新的緩解順鉑腎毒性(cisplatin nephrotoxicity,C-IN)的療法急待開(kāi)發(fā)。

中醫(yī)認(rèn)為,順鉑腎毒屬于“藥毒”范疇[4-5],其根本病機(jī)是邪盛正虛,是腎脾功能受損所致“濕濁中阻”而引起的一種代謝異常性副作用,以祛邪扶正為基本原則,采用祛濕化濁法或可調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、緩解順鉑腎毒性。參苓白術(shù)散是常用的祛濕經(jīng)典名方,具有益氣健脾,滲濕止瀉,通調(diào)水道之功效,主治脾虛濕盛證[6],臨床多與化療藥物聯(lián)用提高患者行為能力。然而參苓白術(shù)散與順鉑聯(lián)用改善C-IN的效果及其機(jī)制均未清楚。因此,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)參苓白術(shù)散核心活性成分、作用通路與關(guān)鍵分子靶點(diǎn),然后應(yīng)用小鼠腎損傷模型驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果,闡明參苓白術(shù)散緩解 C-IN的潛在作用機(jī)制,為開(kāi)發(fā)緩解C-IN的臨床辦法提供新策略。

1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究參苓白術(shù)散緩解C-IN的作用機(jī)制

1.1 資料與方法

1.1.1 參苓白術(shù)散活性成分和靶點(diǎn)的搜集運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php,數(shù)據(jù)收集日期為2022年1月)檢索參苓白術(shù)散中白扁豆、白術(shù)、茯苓、甘草、桔梗、蓮子、人參、砂仁、山藥、薏苡仁的化學(xué)成分,并以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥ 30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥ 0.18為條件進(jìn)行篩選,得出相應(yīng)活性成分及靶標(biāo)蛋白。由于TCMSP平臺(tái)未收錄蓮子的化學(xué)成分,故以“蓮子”為檢索詞,在中醫(yī)藥百科全書(shū)(The encyclopedia of traditional Chinese medicine,ETCM,http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php)、SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.symmap.org/)查找,同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)收集蓮子的成分,通過(guò)PubChem網(wǎng)站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載其2D結(jié)構(gòu)的SDF文件,基于SwissADME(http://www.swissadme.ch/)和SwissTargetPrediction平臺(tái)(http://swisstargetprediction.ch/)篩選出蓮子的活性成分與靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/),選擇物種為“Human”,對(duì)獲得成分靶點(diǎn)信息進(jìn)行基因名稱的規(guī)范統(tǒng)一。

1.1.2 C-IN相關(guān)靶點(diǎn)搜集以“cisplatin-induced kidney injury”“cisplatin-induced renal injury”“cisplatin-induced kidney failure”“cisplatin-induced renal failure”“cisplatin-induced kidney damage”“cisplatin-induced nephrotoxicity”“cisplatin kidney damage”為檢索詞在在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://www.omim.org/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)收集C-IN的靶點(diǎn),其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選條件為Score≥10。將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)匯總,刪除重復(fù)值。

1.1.3 參苓白術(shù)散緩解C-IN的潛在相關(guān)靶點(diǎn)篩選將參苓白術(shù)散活性成分靶點(diǎn)與C-IN疾病相關(guān)靶點(diǎn)錄入Venny 2.1.0軟件,繪制韋恩圖,得到兩者的交集靶點(diǎn),即為參苓白術(shù)散緩解C-IN的潛在靶點(diǎn)。

1.1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)的篩選利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)構(gòu)建交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò),物種選擇“Homo sapiens”,相互作用閾值為0.9,隱去游離靶點(diǎn),將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?篩選同時(shí)大于2倍網(wǎng)絡(luò)中介中心性中位數(shù)、2倍節(jié)點(diǎn)連接度值中位數(shù)、接近中心性中位數(shù)的靶點(diǎn);同時(shí)結(jié)合MCODE模塊篩選核心靶點(diǎn)。MCODE模塊參數(shù)設(shè)置為:Degree cutoff:2,Node Score Cutoff:0.2,K-Core:2。

1.1.5 基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號(hào)通路富集分析將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)中進(jìn)行GO與KEGG分析,其中GO分析包括分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)3個(gè)部分。選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”,物種為“Homo”,根據(jù)Pvalue與Count值篩選結(jié)果。

1.1.6 分子對(duì)接與可視化在RCSB PDB網(wǎng)站(https://www.pdbus.org/)中根據(jù)物種、Score值及分辨率選取核心靶點(diǎn)骨架,在PubChem網(wǎng)站中下載核心化合物的3D結(jié)構(gòu),將兩者導(dǎo)入AutoDock 1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接并計(jì)算結(jié)合能,利用PyMol 2.5軟件進(jìn)行可視化分析。

1.2 結(jié)果

1.2.1 參苓白術(shù)散活性成分及靶點(diǎn)篩選通過(guò)檢索TCMSP、ETCM、SymMap數(shù)據(jù)庫(kù),同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)共獲得參苓白術(shù)散活性成分213個(gè),其中白扁豆1個(gè),白術(shù)7個(gè),茯苓15個(gè),甘草92個(gè),桔梗7個(gè),蓮子34個(gè),人參22個(gè),砂仁10個(gè),山藥16個(gè),薏苡仁9個(gè),去重后共得到204個(gè)活性成分,包括生物堿類、黃酮類、多酚類等,主要活性成分見(jiàn)表1。根據(jù)TCMSP、SwissADME和SwissTargetPrediction平臺(tái)篩選活性化合物的靶點(diǎn),匯總刪除重復(fù)值后共得到靶點(diǎn)335個(gè)。

表1 參苓白術(shù)散主要活性成分

1.2.2 C-IN靶點(diǎn)篩選基于OMIM、Drugbank、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集C-IN的靶點(diǎn),將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)匯總,刪除重復(fù)值共得到C-IN疾病相關(guān)靶點(diǎn)1 298個(gè)。

1.2.3 核心活性成分及核心靶點(diǎn)分析將參苓白術(shù)散活性成分靶點(diǎn)與C-IN疾病相關(guān)靶點(diǎn)錄入Venny 2.1.0軟件,如圖1所示,共得到參苓白術(shù)散緩解C-IN的潛在治療靶點(diǎn)(交集靶點(diǎn))137個(gè),選出靶向治療靶點(diǎn)的活性化合物作為參苓白術(shù)散的有效成分。利用Cytoscape 3.8.2軟件分析參苓白術(shù)散“有效成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),將有效成分按照度值大小排列,得到排名前3位的核心活性成分分別為槲皮素、山柰酚、木犀草素,結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 參苓白術(shù)散緩解順鉑腎毒性的交集靶點(diǎn)韋恩圖

表2 參苓白術(shù)散核心活性成分(度值前10位)

為了進(jìn)一步研究參苓白術(shù)散緩解C-IN的作用機(jī)制,將137個(gè)治療靶點(diǎn)通過(guò)STRING網(wǎng)站進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)共有137個(gè)節(jié)點(diǎn),742條邊(其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),邊表示靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系)。隨后將結(jié)果錄入Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D,分析篩選出同時(shí)大于2倍網(wǎng)絡(luò)中介中心性中位數(shù)(0.006 8)、2倍節(jié)點(diǎn)連接度值中位數(shù)(22)、接近中心性中位數(shù)(0.426 0)的靶點(diǎn)19個(gè)。最后利用MCODE插件選出核心模塊,同時(shí)結(jié)合度值篩選出排名前10位的核心靶點(diǎn)分別為TP53、STAT3、AKT1、HSP90AA1、JUN、SRC、MAPK3、MAPK1、ESR1、PIK3R1,結(jié)果見(jiàn)圖2與表3。

注:圖中節(jié)點(diǎn)越大,顏色越深表明該靶點(diǎn)度值越大,在網(wǎng)絡(luò)中越重要;連線越粗,顏色越深表明靶點(diǎn)之間的關(guān)系越緊密

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)信息

1.2.4 GO與KEGG富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),將137個(gè)治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果共富集得到794項(xiàng)BP,84項(xiàng)CC,152項(xiàng)MF。根據(jù)顯著性與基因富集數(shù)目篩選出排名前10位的GO條目,其中BP主要涉及細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程(cytokine-mediated signaling pathway)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控過(guò)程(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、負(fù)調(diào)控凋亡過(guò)程(negative regulation of apoptotic process)等;CC主要涉及細(xì)胞核(nucleus)、細(xì)胞溶質(zhì)(cytosol)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)等;MF主要涉及蛋白結(jié)合(protein binding)、相同蛋白結(jié)合(identical protein binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)等,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 GO富集分析條形圖

KEGG富集分析共得到188條通路,選取P值排名前20位的通路進(jìn)行可視化分析,結(jié)果如圖4所示,參苓白術(shù)散主要通過(guò)作用于癌癥相關(guān)通路(pathways in cancer)、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)通路(lipid and atherosclerosis)以及糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、PI3K/AKT信號(hào)通路(PI3K/AKT signaling pathway)和MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)等來(lái)緩解C-IN。

注:圓形節(jié)點(diǎn)代表通路。

采用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建參苓白術(shù)散緩解C-IN的“靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò),如圖5所示。對(duì)“靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治龊髮?duì)得到的靶點(diǎn)度值進(jìn)行排序,同時(shí)與1.2.3項(xiàng)下得到的核心靶點(diǎn)比對(duì)取交集,篩選出AKT1、PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3是其關(guān)鍵作用靶點(diǎn)(紅色圖標(biāo))。

注:藍(lán)色三角形為通路;黃色菱形為作用靶點(diǎn);紅色菱形為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)

1.2.5 分子對(duì)接選擇核心活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素分別與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)蛋白AKT1、PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3進(jìn)行分子對(duì)接,進(jìn)一步驗(yàn)證參苓白術(shù)散緩解C-IN的關(guān)鍵成分與作用靶點(diǎn)。較低的結(jié)合能代表配體和蛋白質(zhì)之間較高的親和力,一般認(rèn)為受體和配體的結(jié)合能≤-5.0 kcal·mol-1說(shuō)明兩者有較好的結(jié)合活性[7-8]。分子對(duì)接結(jié)果如表4所示,核心活性成分與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)具有較好結(jié)合活性,且均與MAPK1蛋白有最優(yōu)結(jié)合活性。

表4 參苓白術(shù)散核心活性成分與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

將核心活性成分與MAPK1蛋白對(duì)接結(jié)果經(jīng)PyMol 2.5軟件可視化,結(jié)果見(jiàn)圖6。槲皮素與MAPK1相互作用的氨基酸殘基為異亮氨酸-84、亮氨酸-73、異亮氨酸-81、組氨酸-78、精氨酸-77和亮氨酸-74;山柰酚與MAPK1相互作用的氨基酸殘基為蘇氨酸-61、丙氨酸-33、酪氨酸-34和絲氨酸-55;木犀草素與MAPK1相互作用的氨基酸殘基為天冬氨酸-104、賴氨酸-162、異亮氨酸-81、組氨酸-78和亮氨酸-74。

注:藍(lán)色為MAPK1蛋白骨架結(jié)構(gòu);紅色為活性成分3D結(jié)構(gòu);綠色為氨基酸殘基;黃色虛線為氫鍵;數(shù)字為氫鍵長(zhǎng)度

2 基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證參苓白術(shù)散緩解C-IN的作用機(jī)制

2.1 材料

2.1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠24只,購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(粵)2018-0002,飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SYXK(粵)2018-0094,飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)環(huán)境,溫度23～25 ℃,濕度45%～65%,12 h晝夜節(jié)律,800—2000光照,小鼠自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)通過(guò)了廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查,倫理審查批準(zhǔn)號(hào):202243。

2.1.2 藥物與試劑參苓白術(shù)散(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠,規(guī)格:每袋12 g,批號(hào):21101018);順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司,規(guī)格:30 mg/5 mL,批號(hào):601210607)。優(yōu)級(jí)純硝酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);調(diào)諧液(安捷倫科技有限公司,貨號(hào):5185-5959);鉑(Pt)ICP-MS標(biāo)準(zhǔn)液(美國(guó)o2si Smart Solutions公司,貨號(hào):060078-04-01);尿素氮(urea,BUN)測(cè)試盒 (脲酶法)、肌酐(Creatinine,Cr)測(cè)定試劑盒 (肌氨酸氧化酶法)(微板法)(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):C013-2-1、C011-2-1);HE染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):C0105);中性樹(shù)脂、4%多聚甲醛(上海晶欣生物科技有限公司,貨號(hào):C1010、JX0100);β-actin引物、AKT1引物、TP53引物、PIK3R1引物、MAPK1引物、MAPK3引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司,貨號(hào):AG11711);預(yù)混型qPCR試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司,貨號(hào):AG11701)。

2.1.3 儀器真空冷凍干燥機(jī)(型號(hào):FreeZone,美國(guó)LABCONCO公司);微波消解儀(型號(hào):MARS6,美國(guó)CEM公司);電感耦合等離子體質(zhì)譜(型號(hào):8800ICP-MS,美國(guó)Agilent公司);萬(wàn)分之一天平(型號(hào):BSA323S-CW,德國(guó)Sartorius公司);冷凍離心機(jī)(型號(hào):5418R,德國(guó)Eppendorf公司);恒溫孵育箱(型號(hào):DNP-9162,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);水浴鍋(型號(hào):DK-S22,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);酶標(biāo)儀(型號(hào):EonC,美國(guó)BioTek公司);全自動(dòng)組織脫水機(jī)(型號(hào):VIP6 AI-J2,日本SAKURA公司);組織包埋機(jī)、超微量分光光度計(jì)、熒光定量PCR儀(型號(hào):HistoStar、NanoDrop 2000c、ABI7500,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);切片機(jī)(型號(hào):RM2245,德國(guó)Leica公司);全自動(dòng)染色工作站(型號(hào):ST5020,德國(guó)Leica公司);研究級(jí)電動(dòng)顯微鏡(型號(hào):BX53,日本Olympus公司);梯度PCR儀(型號(hào):Veriti,美國(guó)Applied Biosystems公司)。

2.2 方法

2.2.1 腎損傷動(dòng)物模型制備及分組將24只C56BL/6J雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、減毒組及參苓白術(shù)散組,每組6只。模型組每3天注射1次順鉑注射液(3 mg·kg-1)誘導(dǎo)腎損傷[9-11];減毒組注射順鉑注射液(3 mg·kg-1)同時(shí)灌胃給予參苓白術(shù)散治療(3 g·kg-1);參苓白術(shù)散組僅灌胃給予參苓白術(shù)散(3 g·kg-1),對(duì)照組每天給予等量的生理鹽水。30 d后處死小鼠,取腎臟與血液做后續(xù)研究。通過(guò)觀察腎組織HE病理切片,檢測(cè)小鼠血清中Cre、BUN的含量,同時(shí)采用 ICP-MS檢測(cè)腎組織內(nèi)鉑離子含量判定模型建立是否成功。

2.2.2 鉑離子在腎臟中的含量測(cè)定采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)檢測(cè)腎臟中鉑離子的含量。(1)供試品準(zhǔn)備:將腎臟組織于-80 ℃預(yù)冷24 h后真空干燥研成粉狀保存。稱取適量腎組織凍干粉至消解罐中,加入5 mL硝酸室溫預(yù)消解30 min,按照表5程序完成消解后進(jìn)行趕酸,最后用10%硝酸定容至10 mL。(2)ICP-MS儀器條件:等離子體工作線圈射頻功率為1 550 W,采樣深度8.00 mm,冷卻氣、輔助氣、霧化氣均為氬氣,流速分別為 15.00 L·min-1、1.00 L·min-1和0.99 L·min-1,霧化室溫度為2 ℃,蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為0.30RSP。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:取Pt標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用2%硝酸將其稀釋成濃度分別為0.00 μg·L-1、10.00 μg·L-1、25.00 μg·L-1、50.00 μg·L-1、100.00 μg·L-1、500.00 μg·L-1、1 000.00 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,ICP-MS檢測(cè)后根據(jù)其CPS響應(yīng)值與濃度關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)供試品經(jīng)ICP-MS檢測(cè)后,根據(jù)其CPS響應(yīng)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算檢測(cè)腎組織中鉑離子的含量,并計(jì)算組織的藥物含量,其中300.05為順鉑注射液相對(duì)分子量,195.08為鉑的相對(duì)分子量。

表5 消解程序

順鉑含量=檢測(cè)鉑含量×300.05/195.08

2.2.3 腎功能檢查將小鼠血液離心后取血清,按照試劑盒列出的方法檢測(cè)各組小鼠血清中BUN、Cre的含量。

2.2.4 HE病理檢查腎臟組織經(jīng)脫水、石蠟包埋后,將蠟塊切成4 μm的片狀,在66 ℃烘箱烘烤 2 h,按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色,封片后用病理顯微鏡觀察拍照。

2.2.5 核心靶點(diǎn)的基因表達(dá)水平檢測(cè)取適量腎臟組織提取總RNA并檢測(cè)濃度,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,參照預(yù)混型qPCR試劑盒加入SYBR Green后進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系:10 μL 2X SYBR Green Pro Taq HS Premix,2 μL cDNA,0.8 μL 上游引物,0.8 μL下游引物,0.4 μL ROX Reference Dye(4 μmol·L-1),6 μL無(wú)菌超純水。擴(kuò)增程序:95 ℃ 預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線,記錄Ct值,以β-actin作為內(nèi)參,采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算核心靶點(diǎn)的基因表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表6。

表6 引物序列

2.3 結(jié)果

2.3.1 參苓白術(shù)散顯著減少腎組織內(nèi)鉑離子蓄積采用ICP-MS檢測(cè)各組腎組織內(nèi)鉑離子含量,如表7所示,與對(duì)照組比較,模型組腎組織內(nèi)鉑離子含量明顯升高(P<0.01);與模型組比較,參苓白術(shù)散用藥后(減毒組)能顯著降低鉑離子蓄積(P<0.01),調(diào)節(jié)順鉑代謝。

表7 參苓白術(shù)散緩解順鉑腎毒性評(píng)價(jià)

2.3.2 參苓白術(shù)散能夠降低順鉑腎毒副作用與模型組比較,參苓白術(shù)散與順鉑聯(lián)用能夠降低小鼠血清中BUN(P<0.05)含量,結(jié)果見(jiàn)表7。同時(shí)病理HE結(jié)果表明,模型組小鼠腎臟組織有明顯的結(jié)構(gòu)損傷現(xiàn)象:腎小管變性、壞死(胞漿空泡樣變),管腔內(nèi)有大量受損的管型及脫落的上皮細(xì)胞,細(xì)胞排列紊亂,腎間質(zhì)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);減毒組小鼠腎臟組織中腎小管與腎小球形態(tài)比較清晰,有少量腎小管管壁細(xì)胞壞死,少見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)圖7。根據(jù) Paller 法對(duì)各組小鼠腎小管損傷進(jìn)行病理評(píng)分[12],與模型組比較,減毒組腎小管損傷程度明顯降低(P<0.01),結(jié)果見(jiàn)表7。以上結(jié)果說(shuō)明參苓白術(shù)散能夠有效緩解C-IN。

注:A:對(duì)照組;B:模型組;C:減毒組;D:參苓白術(shù)散組

2.3.3 參苓白術(shù)散與順鉑聯(lián)用對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每5天記錄小鼠體質(zhì)量,結(jié)果顯示對(duì)照組與參苓白術(shù)散組小鼠體質(zhì)量隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程而增長(zhǎng),與對(duì)照組比較,從第20天開(kāi)始模型組和減毒組小鼠體質(zhì)量明顯減少(P<0.01),說(shuō)明參苓白術(shù)散未能緩解順鉑引起的小鼠體質(zhì)量的下降,結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 參苓白術(shù)散與順鉑聯(lián)用對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

2.3.4 參苓白術(shù)散對(duì)小鼠腎組織AKT1、PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3mRNA表達(dá)的影響根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)分析結(jié)果,選取小鼠各組腎組織檢測(cè)復(fù)方關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如表9所示,與對(duì)照組比較,模型組TP53、MAPK1、MAPK3的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,減毒組能夠顯著升高PIK3R1mRNA的表達(dá)(P<0.01),降低TP53、MAPK1、MAPK3的mRNA表達(dá)(P<0.01)。說(shuō)明參苓白術(shù)散可能通過(guò)調(diào)控PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3mRNA的表達(dá)發(fā)揮緩解C-IN的作用。

表9 腎組織中關(guān)鍵作用靶點(diǎn)mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討論

參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》,為中醫(yī)健脾祛濕經(jīng)典名方,由蓮子、薏苡仁(炒)、砂仁、桔梗、白扁豆(炒)、茯苓、人參、甘草、白術(shù)(炒)、山藥組成,具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、改善胃腸功能、抗氧化、抗腫瘤、抗炎等藥理作用[13],臨床上常用參苓白術(shù)散(單用或以加減方)輔助鉑類化療藥治療結(jié)直腸癌、肺癌,以改善術(shù)后患者生活質(zhì)量[14-15]。最新研究發(fā)現(xiàn),參苓白術(shù)散具有鎮(zhèn)痛作用并可延長(zhǎng)肺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠的生存期[16],說(shuō)明參苓白術(shù)散在參與癌癥治療過(guò)程中具有減毒潛力,然而其對(duì)化療藥物的減毒作用與機(jī)制尚不清楚。今后可進(jìn)一步應(yīng)用現(xiàn)代多學(xué)科交叉技術(shù)闡明其作用機(jī)制和有效成分,為參苓白術(shù)散更好地運(yùn)用于臨床治療提供依據(jù)。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析篩選出槲皮素、山柰酚、木犀草素是參苓白術(shù)散的核心活性化合物。槲皮素、山柰酚和木犀草素都是具有多種生物活性的黃酮類化合物。槲皮素具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及免疫調(diào)節(jié)等作用[17],有研究證實(shí)其能夠抑制腎小管細(xì)胞凋亡[18],或通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)等方式緩解順鉑引起的腎毒性[19]。最近有研究制備了槲皮素膠束制劑,在增加槲皮素血藥濃度與生物利用度的同時(shí)保留了其對(duì)順鉑腎毒的緩解作用[20]。山柰酚和木犀草素均具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌、抗炎等功效,能從氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥等多方面緩解順鉑介導(dǎo)的腎毒性[21-22],尤其是木犀草素能夠減少鉑離子在腎臟內(nèi)的蓄積[23],與本研究中參苓白術(shù)散的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫絽④甙仔g(shù)散緩解C-IN的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)為AKT1、PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3。分子對(duì)接顯示槲皮素、山柰酚和木犀草素能較好地與AKT1、PIK3R1、TP53、MAPK1、MAPK3結(jié)合。AKT是PI3K下游主要效應(yīng)分子之一,當(dāng)PI3K與生長(zhǎng)因子受體結(jié)合后,可改變AKT的蛋白結(jié)構(gòu)使其活化,并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物[24],激活A(yù)KT1能夠有效緩解順鉑引起的腎臟毒性[25]。TP53基因是一種抑癌基因,因編碼一種分子量為53 kDa的蛋白質(zhì)(p53蛋白)而得名[26],抑制p53表達(dá)或于近端小管靶向缺失p53可在順鉑腎毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)揮腎保護(hù)作用[27-30]。MAPK是一組進(jìn)化保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶,MAPK1和MAPK3分別編碼細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(extracellular regulated protein kinases 2,ERK2)與ERK1,通過(guò)抑制MAPK1的表達(dá)能夠降低順鉑耳毒性[31],且越來(lái)越多的研究證實(shí)ERK1/2參與改善順鉑副作用[32-33]。此外,5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[34-35],推測(cè)參苓白術(shù)散與化療藥聯(lián)用時(shí)可能參與腫瘤治療進(jìn)程,其配伍效果需要進(jìn)一步深入探究。

GO富集分析發(fā)現(xiàn),參苓白術(shù)散能夠調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白結(jié)合等過(guò)程,進(jìn)一步說(shuō)明中藥復(fù)方具有多層次的藥理功能。KEGG分析結(jié)果表明參苓白術(shù)散緩解C-IN的主要信號(hào)通路為AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路。AGE-RAGE信號(hào)通路是糖尿病腎病重要發(fā)病通路之一,該通路激活后可促使PI3K/AKT和MAPK等通路的激活[36]。PI3K/AKT信號(hào)通路是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,響應(yīng)細(xì)胞外信號(hào),促進(jìn)代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管生成等,PI3K和AKT是該通路的關(guān)鍵基因[37],激活PI3K/AKT信號(hào)通路能抑制腎小管細(xì)胞凋亡,減輕順鉑引起的腎毒性[38-40]。MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、應(yīng)激、炎癥等多種反應(yīng)[41],抑制MAPK通路能夠降低ERK1/2等基因與蛋白的表達(dá),減輕順鉑耐藥與毒副作用[31,42-44]。此外,近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路拮抗MAPK介導(dǎo)的自噬通路能夠抑制順鉑腸毒性[45],進(jìn)一步證明PI3K/AKT與MAPK信號(hào)通路與順鉑的副作用具有相關(guān)性。

為了驗(yàn)證參苓白術(shù)散緩解C-IN的作用,本研究構(gòu)建了C57BL/6J小鼠順鉑腎損傷模型,結(jié)果顯示,參苓白術(shù)散和順鉑聯(lián)用可以降低順鉑在小鼠腎組織的蓄積,調(diào)節(jié)順鉑代謝,降低小鼠血清中BUN和Cre含量,改善腎小管細(xì)胞形態(tài)。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,參苓白術(shù)散能夠降低模型小鼠腎組織TP53、MAPK1及MAPK3mRNA的表達(dá),升高PIK3R1mRNA的表達(dá)。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步預(yù)測(cè)了參苓白術(shù)散在多成分、多靶點(diǎn)、多通路的共同作用下緩解C-IN的作用機(jī)制,同時(shí)利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了參苓白術(shù)散可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮緩解C-IN的作用,為開(kāi)發(fā)降低順鉑毒副作用的臨床辦法提供新思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而中藥復(fù)方成分復(fù)雜且具有作用通路與靶點(diǎn)不唯一的特點(diǎn),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析仍有一定局限性,后續(xù)需要更深入的分子生物學(xué)與臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)探究。