戚良軒　徐晴玉　李晶　鞠佳菲　孫洋　方繼朝　紀(jì)銳

摘要： 灰飛虱是一種小型的刺吸式口器昆蟲(chóng)，是危害水稻的主要害蟲(chóng)之一?；绎w虱刺吸取食時(shí)分泌的膠狀唾液可形成唾液鞘，保護(hù)口針并幫助取食，同時(shí)其中的蛋白質(zhì)效應(yīng)子在調(diào)控作物免疫中扮演重要角色。本研究利用掃描電子顯微鏡觀察了灰飛虱唾液鞘的形態(tài)：多呈樹(shù)枝狀，表面為較為光滑的珠狀結(jié)構(gòu)。應(yīng)用雙層膜裝置收集了若蟲(chóng)的唾液鞘，經(jīng)液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)鑒定得到42種灰飛虱唾液鞘蛋白質(zhì)，其中19種蛋白質(zhì)檢測(cè)到2個(gè)及以上的唯一肽段。進(jìn)一步分析了編碼這19種蛋白質(zhì)的基因在各個(gè)組織中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)基因在唾液腺中明顯高表達(dá)，推測(cè)其可能參與了唾液鞘的形成以及害蟲(chóng)-作物的互作。唾液鞘蛋白質(zhì)組分鑒定為后續(xù)篩選和研究灰飛虱效應(yīng)子功能提供了基礎(chǔ)，有助于明確灰飛虱-水稻互作的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)害蟲(chóng)綠色防控新策略提供思路。

關(guān)鍵詞： 灰飛虱；唾液鞘；蛋白質(zhì)組分

中圖分類號(hào)： S435.112 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）01-0030-07

Morphology and protein identification of salivary sheath from Laodelphax striatellus

QI Liang-xuan¹， XU Qing-yu¹， LI Jing¹， JU Jia-fei¹， SUN Yang²， FANG Ji-chao^1，3， JI Rui^{1，2，3}

（1.Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.Key Laboratory for Conservation and Use of Important Biological Resources of Anhui Province/College of Life Sciences， Anhui Normal University， Wuhu 241000， China;3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture & Environmental Protection/Huaiyin Normal University， Huai′an 223300， China）

Abstract： Small brown planthopper （SBPH） Laodelphax striatellus， the tinny sap-sucking insects， is one of the most destructive herbivores damaging rice in China. During the feeding process， gel saliva secreted by SBPHs can form the salivary sheath to protect stylet and help feeding. Some protein effectors in the salivary sheath play important roles in regulating plant immunity. Here， we observed the morphology of SBPH salivary sheaths under scanning electron microscope： most salivary sheaths were dendritic and had smooth bead structures in the surface. The salivary sheaths of SBPH nymphs were collected using double membrane device. After the liquid chromatography-tandem mass spectrometer （LC-MS/MS）analysis， 42 proteins were finally identified in the salivary sheaths，? and among them， 19 proteins with two or more unique peptides were detected. Using quantitative polymerase chain reaction， we analyzed the expression patterns of genes encoding these 19 proteins in different tissues of SBPH， and found eight genes with dramatically higher expression levels in the salivary gland， suggesting their importance in the formation of salivary sheaths and interaction of insect and plant. These results lay a solid foundation for studying the function of SBPH salivary sheath， revealing the detailed mechanism of SBPH-rice interaction， and developing green pest management strategies.

Key words： Laodelphax striatellus;salivary sheath;protein component

作物與害蟲(chóng)之間一直存在共同進(jìn)化的“軍備”競(jìng)賽。作物通過(guò)受體識(shí)別與感知害蟲(chóng)的相關(guān)分子信號(hào)激活一系列的免疫反應(yīng)，比如：誘發(fā)鈣離子內(nèi)流，激活絲裂原活化蛋白激酶途徑，誘導(dǎo)活性氧爆發(fā)和抗蟲(chóng)激素積累，進(jìn)而產(chǎn)生有毒物質(zhì)影響昆蟲(chóng)的取食、發(fā)育，或產(chǎn)生揮發(fā)物來(lái)吸引害蟲(chóng)天敵。相應(yīng)地，害蟲(chóng)也進(jìn)化出各種對(duì)抗策略來(lái)逃避與破解植物的防御反應(yīng)，分泌效應(yīng)子至宿主作物體內(nèi)就是其中的重要策略之一^[1]。

灰飛虱（Laodelphax striatellus）等刺吸式口器害蟲(chóng)在取食過(guò)程中，向作物體內(nèi)不斷地分泌2種類型的唾液——水狀唾液與膠狀唾液，調(diào)控植物免疫，幫助昆蟲(chóng)取食^[2]。水狀唾液中的酶類可以將植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)初步降解，有利于消化吸收，部分效應(yīng)子還能以多種形式與植物抗蟲(chóng)因子相互作用，比如，（1）酶解宿主植物中的抗蟲(chóng)物質(zhì)：褐飛虱（Nilaparvata lugens）唾液中的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶能分解水稻中的纖維素，便于口針在水稻細(xì)胞間和向細(xì)胞內(nèi)穿刺時(shí)突破細(xì)胞壁屏障，幫助其順利取食^[3]?；绎w虱唾液中的DNase II 能夠降解刺吸損傷時(shí)植物產(chǎn)生的胞外DNA，進(jìn)而抑制刺吸損傷誘導(dǎo)的防御反應(yīng)^[4]；（2）與植物細(xì)胞內(nèi)的金屬離子結(jié)合：褐飛虱和灰飛虱唾液中的鈣結(jié)合蛋白通過(guò)結(jié)合水稻細(xì)胞質(zhì)中的Ca²⁺，阻斷鈣信號(hào)通道，抑制取食所誘導(dǎo)的水稻胼胝質(zhì)沉積以及抗蟲(chóng)信號(hào)分子的積累^[5-7]；（3）與植物中的關(guān)鍵抗蟲(chóng)蛋白質(zhì)互作：灰飛虱效應(yīng)子卵黃原蛋白在細(xì)胞核中與免疫調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子OWRKY71互作，并抑制其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制OsWRKY71介導(dǎo)的防御反應(yīng)^[8]；煙粉虱（Bemisia tabaci）效應(yīng)子Bt56、Bsp9、Armet分別和寄主植物中的轉(zhuǎn)錄因子NTH202和WRKY33以及半胱氨酸蛋白酶抑制子CYS6互作，抑制植物免疫^[9-11]。然而，膠狀唾液的成分鑒定和功能分析的報(bào)道相對(duì)較少，目前僅在褐飛虱中鑒定到16種蛋白質(zhì)^[12]。膠狀唾液分泌進(jìn)入植物體內(nèi)后凝結(jié)成唾液鞘，包裹、潤(rùn)滑和保護(hù)口針^?[13]，還能隔絕口針和植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的接觸，封閉針刺產(chǎn)生的細(xì)胞傷口，防止植物細(xì)胞內(nèi)容物外流所引發(fā)的免疫反應(yīng)。飛虱唾液鞘中的主要蛋白質(zhì)（Salivary sheath protein和Mucin）對(duì)于唾液鞘的形成和取食至關(guān)重要^[14-15]，沉默Mucin能影響飛虱的取食行為，不利于植物病毒的水平傳播^[16]，而且Mucin還可以被作物識(shí)別，激發(fā)強(qiáng)烈的防御反應(yīng)^[15]。

灰飛虱屬半翅目飛虱科害蟲(chóng)，由其直接取食、產(chǎn)卵和傳播病毒病所引起的糧食減產(chǎn)損失極其嚴(yán)重。唾液是植物-病毒-昆蟲(chóng)三者互作的關(guān)鍵因素，鑒定灰飛虱的唾液鞘蛋白效應(yīng)子，設(shè)計(jì)相應(yīng)策略阻斷這些唾液效應(yīng)子的功能，一方面可以有效地控制灰飛虱的直接危害，另一方面通過(guò)抑制其取食來(lái)阻斷作物病毒的水平傳播，起到“一石二鳥(niǎo)”的作用。本研究擬在電子顯微鏡下觀察灰飛虱唾液鞘的形態(tài)，利用液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatography-tandem mass spectrometer ，LC-MS/MS）等方法鑒定灰飛虱唾液鞘蛋白質(zhì)組分，并采用定量PCR技術(shù)對(duì)唾液鞘基因的組織表達(dá)模式進(jìn)行分析，為后續(xù)效應(yīng)子篩選積累重要的蛋白質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

灰飛虱在人工氣候室內(nèi)[溫度：（28±1） ℃；光周期：14 h光照、10 h黑暗]以南粳9108稻苗為寄主進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 雙層膜夾蔗糖溶液

用高壓滅菌后的超純水溶解蔗糖，配置成2.5%的蔗糖溶液，經(jīng)針孔式過(guò)濾器（濾膜孔徑0.22 μm） 除菌。將Parafilm 膜裁成小方塊，置于紫外燈下滅菌1 h。將充分拉伸過(guò)的膜覆蓋在雙通玻璃管的一端，另一端用紗布包住透氣。將80 μl蔗糖溶液滴到膜的中央位置，再覆上第2層膜，壓緊2層膜使蔗糖溶液在膜間充分鋪展。

1.3 唾液鞘樣品處理及形態(tài)觀察

（1）樣品收集與清洗：將約60頭4～5齡灰飛虱若蟲(chóng)放進(jìn)雙通管中，待灰飛虱在上述的Parafilm 膜上取食蔗糖溶液24 h后，用75%乙醇溶液輕輕漂洗帶有唾液鞘的膜。（2）固定：將4%多聚甲醛與2.5%戊二醛（2∶1，體積比）混合配置成固定液，對(duì)Parafilm膜進(jìn)行固定，然后去除固定液，并用PBS溶液進(jìn)行清洗。（3）脫水：用梯度濃度的乙醇溶液（30%～100%）對(duì)樣品進(jìn)行梯度脫水。（4）置換：向上述樣品中倒入醋酸異戊酯和乙醇（1∶2，體積比）的混合液，適當(dāng)搖動(dòng)10 min；轉(zhuǎn)移膜至醋酸異戊酯∶乙醇（1∶1，體積比）的混合液中，搖動(dòng)10 min；最后轉(zhuǎn)移膜至醋酸異戊酯中，緩慢搖動(dòng)10 min，從樣品中充分置換出乙醇。（5）干燥：用濾紙吸除樣品表面殘留的醋酸異戊酯，將樣品膜在室溫下干燥24 h，然后轉(zhuǎn)移至50 ℃的烘箱中，干燥2 h；（6）粘樣、鍍膜：采用導(dǎo)電雙面膠將膜粘到樣品臺(tái)上，利用離子濺射法鍍膜；（7）樣品觀察：在掃描電鏡觀察室進(jìn)行觀察，拍攝獲得唾液鞘的清晰圖片。涉及的具體方法參照文獻(xiàn)[17]。

1.4 唾液鞘收集

在體視顯微鏡下觀察，用鑷子從Parafilm膜上取下完整的唾液鞘，放入SDT蛋白裂解液中，-80 ℃保存。取約6 000頭若蟲(chóng)的唾液鞘，超聲波破碎處理（100 W工作10 s，間歇10 s，循環(huán)10次），沸水浴10 min。離心后取上清液，利用胰蛋白酶進(jìn)行充分酶解，獲得肽段。

1.5 LC-MS/MS測(cè)定

上述酶解后的肽段上樣到經(jīng)0.1%甲酸溶液平衡過(guò)的色譜柱，再經(jīng)分析柱分離，HPLC系統(tǒng)流速設(shè)定為0.3 μl/min。色譜分離后的產(chǎn)物進(jìn)一步用Q-Exactive質(zhì)譜儀檢測(cè)2 h。

1.6 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和蛋白質(zhì)鑒定

將獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用MASCOT軟件比對(duì)灰飛虱基因組預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/？taxon=195883&annotated_only=true&refseq_annotation=true&genbank_annotation=true）。參數(shù)設(shè)定如下：enzyme為trypsin；missed cleavage sites為2；fixed modification為carbamidomethyl；varialbe modification為oxidation（M）和Acetyl（Protein N-term）；過(guò)濾參數(shù)FDR≤0.01。

1.7 灰飛虱各組織總RNA提取和熒光定量PCR分析

灰飛虱各組織總RNA的提取參照普洛麥格生物技術(shù)有限公司的總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的總RNA用瓊脂糖凝膠電泳和艾本德有限公司的微量分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。cDNA合成參照寶生物工程有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。定量PCR配置體系和方法參照寶生物工程有限公司的染料法熒光定量試劑盒（TB Green^TMPremix Ex Taq^TMkit）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在羅氏的LightCycler 480 II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)?；绎w虱延伸因子基因（EF-1）為內(nèi)參基因，唾液鞘基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2^-△Ct方法^[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰飛虱唾液鞘形態(tài)

利用掃描電子顯微鏡觀察Parafilm膜上的灰飛虱唾液鞘的形態(tài)。唾液鞘多為樹(shù)枝狀，可有多個(gè)分叉，大多數(shù)表面為較光滑的珠狀結(jié)構(gòu)（圖1）。

2.2 灰飛虱唾液鞘樣品質(zhì)量檢測(cè)

收集到69.7 μg灰飛虱唾液鞘蛋白質(zhì)，利用SDS-PAGE分析了唾液鞘樣品的質(zhì)量，蛋白質(zhì)條帶（考染）清晰、豐富（圖2），表明唾液鞘蛋白質(zhì)含量較高，并且未發(fā)生明顯的降解和損失。唾液鞘樣品質(zhì)量較好，可滿足后續(xù)蛋白質(zhì)組分測(cè)定的要求。

2.3 灰飛虱唾液鞘蛋白質(zhì)鑒定與注釋

利用LC-MS/MS檢測(cè)了灰飛虱唾液鞘的蛋白質(zhì)成分，共鑒定到42種蛋白質(zhì)，其中19種蛋白質(zhì)檢測(cè)到的肽段數(shù)量較多，有2～34個(gè)唯一肽段；其他23種蛋白質(zhì)只檢測(cè)到1條唯一肽段。利用SignalP-5.0預(yù)測(cè)這些唾液鞘蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列：僅4個(gè)含信號(hào)肽，分別是精氨酸激酶和肌動(dòng)蛋白，以及2個(gè)未知功能蛋白質(zhì)（KAF7751974.1和RZF33379.1）。

將鑒定到的蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)到NCBI的Non-Redundant Protein（NR）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)其中36個(gè)具有功能注釋結(jié)果（表1）。肌球蛋白重鏈在唾液鞘蛋白質(zhì)中含量最高，檢測(cè)到34個(gè)唯一肽段。副肌球蛋白質(zhì)的含量次之，檢測(cè)到12個(gè)唯一肽段。

2.4 灰飛虱唾液鞘基因的組織表達(dá)模式

檢測(cè)到19種唾液鞘蛋白質(zhì)的唯一肽段數(shù)≥2（表1），表明這些蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果可信度較高，因此利用定量PCR探究了這19個(gè)基因在灰飛虱各組織中的表達(dá)模式，引物見(jiàn)表2。結(jié)果（圖3）表明，編碼副肌球蛋白、精氨酸激酶、原肌球蛋白-1、延伸因子1-α、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2、堿性肌球蛋白輕鏈、組蛋白H2B以及微管蛋白β-1鏈的8個(gè)基因在唾液腺中特異性高表達(dá)，而在脂肪體、腸道、精巢以及卵巢中表達(dá)量很低。其余基因在灰飛虱各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)。

3 討論

本研究利用掃描電子顯微鏡觀察到灰飛虱唾液鞘呈樹(shù)枝狀的清晰形態(tài)，并收集了大量的灰飛虱唾液鞘樣品，利用LC-MS/MS測(cè)定了其蛋白質(zhì)組分，鑒定得到42個(gè)灰飛虱唾液鞘蛋白質(zhì)，其中ATP合成酶，肌動(dòng)蛋白和Mucin在褐飛虱唾液鞘蛋白質(zhì)中也被鑒定到^[12]，其他唾液鞘蛋白質(zhì)組分為首次報(bào)道。我們鑒定到的灰飛虱唾液鞘蛋白質(zhì)數(shù)量雖然比褐飛虱唾液鞘中鑒定得到的蛋白質(zhì)數(shù)量（16種）要多^[12]，但是遠(yuǎn)少于水狀唾液中鑒定得到的蛋白質(zhì)數(shù)量（褐飛虱水狀唾液中鑒定到149種蛋白質(zhì)，灰飛虱中鑒定到236種）^[18]，這說(shuō)明水狀唾液中蛋白質(zhì)比膠狀唾液中蛋白質(zhì)的種類和功能更豐富，這可能是因?yàn)樗疇钔僖簠⑴c了飛虱取食、體外消化和降解、調(diào)控水稻防御等多種功能，而膠狀唾液多為結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)，其主要參與唾液鞘形成。

水狀唾液中的降解酶可以幫助昆蟲(chóng)體外消化、分解植物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗性因子。本研究在唾液鞘中雖然未檢測(cè)到相關(guān)的降解酶，但鑒定到一些與能量代謝相關(guān)的酶，比如ADP /ATP 轉(zhuǎn)移酶和5種ATP合成酶，這在稻飛虱水狀唾液、膠狀唾液中也被檢測(cè)到^[5，12]，其可能在植物中發(fā)揮了與消耗能量相關(guān)的功能。此外，還發(fā)現(xiàn)了肌球蛋白、原肌球蛋白、副肌球蛋白、微管蛋白、肌動(dòng)蛋白等參與維持細(xì)胞功能的一些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，推測(cè)這些蛋白質(zhì)可能與唾液鞘的形成有關(guān)，其在昆蟲(chóng)-植物互作中的功能尚需進(jìn)一步研究。

灰飛虱唾液鞘蛋白質(zhì)組分比較豐富，但僅有4個(gè)蛋白質(zhì)含有信號(hào)肽，這與其他刺吸式口器昆蟲(chóng)唾液中大部分蛋白質(zhì)不含信號(hào)肽類似，說(shuō)明除了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體這一經(jīng)典的分泌途徑外，唾液蛋白質(zhì)還有著其他非經(jīng)典的分泌方式^[12]。不同的唾液鞘基因在灰飛虱各組織中的表達(dá)模式不盡相同，測(cè)定的19個(gè)基因中，42%的基因在唾液腺中的表達(dá)水平顯著高于在其他組織中的表達(dá)量，這些蛋白質(zhì)可能在唾液腺中合成，然后被分泌到寄主作物中，主要在保持唾液腺的生理功能、維持正常的取食行為或調(diào)控水稻防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它們是潛在的效應(yīng)子。

唾液鞘蛋白質(zhì)除了具有參與唾液鞘形成以及介導(dǎo)昆蟲(chóng)與植物互作的功能，還可能參與植物病毒的傳播。普通的非蟲(chóng)接種方式很難使病毒感染植物，唾液作為植物-病毒-昆蟲(chóng)三者互作的關(guān)鍵因素，極可能是病毒侵染作物并且傳播爆發(fā)的關(guān)鍵因子。水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）隨著灰飛虱唾液進(jìn)入到水稻中，最近研究發(fā)現(xiàn)唾液鞘蛋白質(zhì)Mucin與唾液鞘形成相關(guān)，通過(guò)影響灰飛虱的取食行為來(lái)干擾RSV的水平傳播，表明正常結(jié)構(gòu)的唾液鞘對(duì)于刺吸式口器害蟲(chóng)水平傳播植物病毒極為重要^[16]。

由于唾液鞘蛋白質(zhì)在植物-病毒-昆蟲(chóng)互作中的重要性及其功能的多樣性，本研究鑒定到的42種灰飛虱唾液鞘蛋白質(zhì)是研究灰飛虱-水稻-病毒互作過(guò)程中的重要里程碑。深入研究這些蛋白質(zhì)在幫助灰飛虱危害作物和傳播病毒過(guò)程中的作用，一方面有利于明晰害蟲(chóng)-病毒-作物互作背后復(fù)雜的分子機(jī)制等基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題，另一方面鑒定出的效應(yīng)子以及與效應(yīng)子互作的水稻抗蟲(chóng)因子，可以成為抗性育種、新型RNAi 生物農(nóng)藥、高效防控的新靶標(biāo)，這對(duì)于制定害蟲(chóng)可持續(xù)治理對(duì)策、研發(fā)新的綠色防控產(chǎn)品及技術(shù)，具有重要價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）