范軍強　路曉明　王會文　武軍艷　劉麗君　馬驪　蒲媛媛　李學(xué)才　孫萬倉

摘要： 為探究不同抗寒性甘藍型冬油菜在應(yīng)對低溫脅迫時內(nèi)源激素含量的變化，并闡明其抗寒性與葉片激素含量的關(guān)聯(lián)性，選用感溫性差異較大的4個甘藍型冬油菜品種（品系），分別于4 ℃及0 ℃處理不同時間后測定植株葉片內(nèi)玉米素（Zeatin，ZT）、赤霉素（Gibberellin A₃，GA₃）、水楊酸（Salicylic acid，SA）、生長素（Indole-3-acetic acid，IAA）和脫落酸（Abscisic acid，ABA）5種內(nèi)源激素的含量，并聯(lián)系抗寒性評價指標進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，與對照（24 ℃）相比，低溫處理后甘藍型冬油菜葉片中IAA、ZT、GA₃含量顯著降低，ABA含量較對照（24 ℃）上升2～3倍，不同品種（品系）SA含量增幅差異較大。相關(guān)性分析結(jié)果表明，ABA、IAA、GA₃、SA含量的耐寒系數(shù)與抗寒性呈顯著負相關(guān)?？傊?，內(nèi)源激素含量會隨外界溫度變化而變化，且強抗寒性甘藍型冬油菜品種（品系）葉片中激素含量的變化（上升或下降）幅度小于弱抗寒性品種（品系）。

關(guān)鍵詞： 甘藍型冬油菜；低溫脅迫；半致死溫度；內(nèi)源激素；抗寒性

中圖分類號： S565.401 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）01-0015-07

Association between cold resistance and leaf hormone content of Brassica napus L. under low temperature stress

FAN Jun-qiang^1，2， LU Xiao-ming^1，2， WANG Hui-wen^1，2， WU Jun-yan^1，2， LIU Li-jun²， MA Li²， PU Yuan-yuan^1，2， LI Xue-cai^1，2， SUN Wan-cang^1，2

（1.College of Agronomy，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070， China;2.State Key Laboratory of Aridland Crop Science， Lanzhou 730070， China）

Abstract： To study the changes of endogenous plant hormone content in Brassica napus L. varieties （strains） with different cold resistance under low temperature stress， and to clarify the correlation between their cold resistance and leaf hormone content， four B. napus L. varieties （strains） with great difference in temperature sensitivity were selected and were treated at 4 ℃， 0 ℃ for different times， respectively. Then contents of five endogenous hormones in the leaves of the plants were detected， such as zeatin （ZT）， gibberellin A₃（GA₃）， salicylic acid （SA）， indole-3-acetic acid （IAA） and abscisic acid （ABA）， and correlation analysis was made with evaluation indexes of cold resistance. The results showed that， compared with the control （24 ℃）， contents of IAA， ZT and GA₃in leaves of B. napus L. decreased significantly after low temperature treatment， and content of ABA increased by two to three times. The increase amplitude of SA content in different varieties （strains） of B. napus L. was different. Results of correlation analysis showed that， the cold resistance coefficients of ABA， IAA， GA₃and SA contents were significantly negatively correlated with cold resistance. In conclusion， the endogenous hormone content changes with the change of external temperature， and the change （increase or decrease） of hormone content in leaves of B. napus L. varieties （strains） with strong cold resistance was less than that of varieties（strains） with weak cold resistance.

Key words： Brassica napus L.;low temperature stress;Semi-lethal temperature;Endogenous auxin;cold resistance;Correlation analysis

低溫逆境下植物內(nèi)源激素會調(diào)控相關(guān)結(jié)構(gòu)的建成與功能表達^[1]，同時在植物適應(yīng)逆境的過程中發(fā)揮重要作用。冬油菜種植區(qū)在向天水市以西、以北方向擴展的過程中，最早實施的就是甘藍型冬油菜^[2]。隨著北移工作的推進，甘藍型冬油菜作為蜜源植物、油料作物和觀賞作物，具有極大的經(jīng)濟價值與生態(tài)價值^[3]。冷脅迫后植物內(nèi)源激素含量會發(fā)生明顯變化^[4]，脫落酸（Abscisic acid，ABA）在低溫環(huán)境下會大量合成^[5]，這會引起相關(guān)抗逆蛋白質(zhì)的合成^[6]。多數(shù)學(xué)者認為植物激素是抗寒基因表達的啟動因素^[7]。闡明低溫下抗寒性與激素調(diào)控的關(guān)系，將為推動冬油菜越冬研究提供新方向。本研究選取感溫性差異較大的4個甘藍型冬油菜品種，低溫處理后測定內(nèi)源激素水平及葉片低溫半致死溫度，以探究甘藍型冬油菜抗寒性與葉片激素含量的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取4個感溫性不同的甘藍型冬油菜品種作為試驗材料，詳見表1。

內(nèi)源激素含量測定使用四元梯度超快速液相色譜儀（型號：ACQUITY Arc）。5種植物內(nèi)源激素標準品玉米素（Zeatin，ZT）、赤霉素（Gibberellin A₃，GA₃）、水楊酸（Salicylic acid，SA）、生長素（Indole-3-acetic acid，IAA）和脫落酸（Abscisic acid，ABA），均采購于上海源葉生物科技有限公司。流動相溶液乙腈（色譜專用）、甲醇（色譜專用）、磷酸（分析純），均采購于上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

試驗材料以盆栽方式進行種植。各品種種子在2021年8月21日于培養(yǎng)皿中進行萌發(fā)，并于2021年8月25日統(tǒng)一移栽。移栽選用直徑為25 cm、高度為12 cm的樹脂花盆。每盆裝入已加水攪拌均勻的育苗基質(zhì)4 kg，每盆設(shè)置3穴，每穴2株苗，株距10 cm，放置于自然條件下生長，地點位于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)。兩葉一心期進行間苗，每穴定苗一株，待長至六葉期進行下一步試驗。種植期間的栽培管理措施按常規(guī)方法進行。

試驗共設(shè)置5個處理，分別為24 ℃處理12 h、0 ℃處理1 h、0 ℃處理12 h、4 ℃處理1 h和4 ℃處理12 h（全部盆栽均先置于24 ℃培養(yǎng)12 h）。處理過程中盡量保證光照及水分條件的一致。

處理結(jié)束后快速取出盆栽并采樣，每株展開的第2張葉用于內(nèi)源激素含量的測定，第3張葉用于低溫半致死溫度的測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 半致死溫度（LT₅₀）的測定 試驗材料于24 ℃培養(yǎng)12 h后，用打孔器在展開的第3張葉上打3個直徑為5 mm的葉圓片（避開葉脈）。將打好的3個葉圓片裝入10 ml離心管中并加入0.2 ml去離子水，對照只加入去離子水，分別置于0 ℃、-4 ℃、-8 ℃、-12 ℃、-16 ℃條件下處理30 min，每個溫度下設(shè)置3個重復(fù)。取出后再加入10 ml去離子水，室溫振蕩1 h后使用電導(dǎo)儀測出電導(dǎo)率（C1），測得對照電導(dǎo)率為C0。最后置于120 ℃烘箱中煮沸20 min，取出冷卻至室溫后定容至10.2 ml，測出電導(dǎo)率（C2），按公式計算相對電導(dǎo)率，相對電導(dǎo)率（REC）=（C1-C0）/（C2-C0）×100％。

1.3.2 高效液相色譜（HPLC）法測定內(nèi)源激素

1.3.2.1 激素的提取 稱取0.5 g新鮮葉片，加入液氮快速充分研磨成粉末。加入4 ℃預(yù)冷后的80%（體積分數(shù)）甲醇（色譜專用）5 ml，使用超聲波清洗儀于22 ℃處理2 min，振蕩混勻，置于4 ℃浸提12 h。浸提結(jié)束后于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，吸取上清液3 ml轉(zhuǎn)移至新離心管，使用真空離心濃縮儀完全濃縮至無液體殘留。加入1 ml 80%（體積分數(shù)）甲醇（色譜專用），振蕩混勻（保證提取物完全溶解于甲醇溶液），過0.22 μm有機濾膜，樣品制備完成。

1.3.2.2 標準品的配制 準確稱取5種激素的標準品，配制成10 μg/ml的高質(zhì)量濃度單個標準品，用于出峰時間的確定及混合標準品的配制。將配制好的高質(zhì)量濃度單個標準品混合稀釋為1 μg/L、95 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、300 μg/L、400 μg/L、600 μg/L、800 μg/L、1 000 μg/L的梯度混合標準品，用于繪制各激素的標準曲線。

1.3.2.3 內(nèi)源激素的測定方法 色譜柱C18W柱，流動相由甲醇與0.1%磷酸按1∶9的體積比例混合配制而成（超聲波處理15 min脫氣），檢測波長280 nm，流速1 ml/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μl，單個樣品檢測時間30 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法

1.4.1 Logistic回歸方程分析 對測定的相對電導(dǎo)率進行Logistic回歸分析，回歸模型為：

其中，Y為相對電導(dǎo)率，t為處理溫度，k為細胞傷害率的飽和容量，a、b為方程參數(shù)。因本試驗中細胞傷害率消除了干擾，故k=100。為確定a、b值，將Logistic方程轉(zhuǎn)化為：

則方程轉(zhuǎn)化為Y′與t之間的線性方程，即：

Y′=lna-bt

半致死溫度計算公式為：

1.4.2 激素水平的計算方法 標準曲線的繪制：使用10 μg/ml的高質(zhì)量濃度單個標準品確定每種激素的出峰時間，使用梯度質(zhì)量濃度的混合標準品確定5種激素峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系，并繪制標準曲線。依據(jù)標準曲線得到樣品質(zhì)量濃度，通過公式計算葉片激素含量：M=C×V/M_S，其中V是定容體積，M_S是樣品質(zhì)量，C為依據(jù)標準曲線得到的激素濃度，M為最終葉片激素含量。單項指標耐寒系數(shù)（K）=低溫測定值/常溫測定值。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍型冬油菜葉片半致死溫度

相對電導(dǎo)率可表示細胞膜透性，離體葉片在一定溫度范圍內(nèi)的滲透情況具有反映細胞膜受傷程度的作用。當處理溫度低于半致死溫度時，植物將受到不可逆的傷害，相對電導(dǎo)率快速升高。低溫半致死溫度的高低是反映植物抗寒性強弱的重要指標。根據(jù)LT₅₀測定結(jié)果（表2）鑒定4個油菜品種（品系）的抗寒性強弱為gau-24>gau-30>天油2288>天油2266，決定系數(shù)為0.86～0.93，可用于進一步分析。

2.2 標準曲線的繪制及回歸方程的建立

對單個標準品進行色譜分析，ZT出峰時間為5.084 min，GA₃出峰時間為6.540 min，SA出峰時間為7.306 min，IAA出峰時間為8.039 min，ABA出峰時間為8.985 min。對照出峰時間獲得各激素梯度濃度的峰面積，求得各激素濃度與峰面積的線性關(guān)系（表3）。

2.3 不同抗寒性甘藍型冬油菜激素含量

0 ℃、4 ℃測得的激素含量分別列于表4、表5。

分析發(fā)現(xiàn)部分激素含量在不同處理間差異顯著（P<0.05）。隨低溫（0 ℃及4 ℃）處理時間的增加，ABA/IAA值、ABA/ZT值、ABA/GA₃值、IAA/GA₃值表現(xiàn)出增大趨勢，各激素間協(xié)同作用明顯。

2.4 不同水平低溫對甘藍型冬油菜內(nèi)源激素含量的影響

4個甘藍型冬油菜品種（品系）內(nèi)源激素對低溫脅迫的響應(yīng)如圖1所示。與對照（24 ℃）相比，0 ℃處理12 h后ZT含量平均降幅為35.84%，高于4 ℃處理的平均降幅（28.79%）。GA3含量隨低溫處理時間延長呈下降趨勢，gau-24在0 ℃處理12 h后降至30.55 μg/g，高于天油2288（18.08 μg/g）。gau-30在0 ℃處理12 h后SA含量與對照相比增加460.82%，天油2288增幅僅為95.71%。在0 ℃處理12 h后平均IAA含量為12.13 μg/g，低于4 ℃處理12 h后的平均含量（28.49 μg/g）。在4 ℃及0 ℃處理后ABA含量明顯上升，gau-24的ABA含量在0 ℃處理12 h后自CK的6.73 μg/g上升至29.71 μg/g，增加了341.46%，高于天油2266及天油2288在0 ℃處理12 h后的增幅。0 ℃處理12 h后ABA含量平均增幅為282.63%，4 ℃處理12 h后ABA含量平均增幅為205.31%，0 ℃上升幅度較4 ℃大?？傮w上看，5種內(nèi)源激素含量隨低溫處理強度變化而變化，低溫處理后ZT、GA₃、IAA含量下降，SA及ABA含量升高，且4 ℃處理的增加或下降幅度小于0 ℃。

2.5 低溫脅迫后不同抗寒性甘藍型冬油菜葉片激素含量與抗寒性的關(guān)系

0 ℃及4 ℃處理12 h后甘藍型冬油菜葉片5種內(nèi)源激素含量及比值的耐寒系數(shù)分別列于表6、表7。ZT、GA₃、IAA的K值均小于1.000，SA、ABA的K值均大于1.000。

利用半致死溫度與9個內(nèi)源激素相關(guān)指標的耐寒系數(shù)之間的相關(guān)性確定甘藍型冬油菜抗寒性與葉片激素含量的關(guān)聯(lián)性。0 ℃處理12 h后，與半致死溫度相關(guān)性顯著或極顯著的指標有GA₃含量、SA含量、IAA含量、ABA含量、ABA/IAA值、ABA/GA₃值的耐寒系數(shù)，4 ℃處理12 h后，與半致死溫度顯著或極顯著相關(guān)的指標僅有GA₃含量和ABA/ZT值的耐寒系數(shù)，GA₃在0 ℃及4 ℃處理后12 h后均與半致死溫度極顯著相關(guān)（表8）。

3 討論與結(jié)論

生長促進型激素和生長抑制型激素對于低溫的響應(yīng)趨勢不同^[8]。低溫處理下云霧貢茶IAA含量下降明顯^[9]。Yamada等^[10]在5 ℃低溫處理的枳砧葉片中未檢測出細胞分裂素。本試驗在0 ℃處理12 h后的甘藍型冬油菜葉片中雖能檢測出玉米素（細胞分裂素的一種），但含量降幅顯著。嚴寒靜等^[11]發(fā)現(xiàn)，梔子葉片中GA₃含量在自然降溫過程中下降明顯。低溫會促進植物體內(nèi)脫落酸水平升高，環(huán)境溫度降低后油菜葉片中脫落酸水平會不斷升高^[12]。番茄在感受夜間低溫后，脫落酸升高至白天的1.5倍^[13]。李亮等^[14]認為，低溫脅迫后SA的積累影響黃瓜幼苗對低溫的響應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，0 ℃處理12 h后油菜葉片中ABA含量較對照（24 ℃處理12 h）上升2～3倍，SA含量也表現(xiàn)增長趨勢。

低溫處理后抗寒性強的番茄品種ABA含量高于抗寒性弱的品種^[15]。不同抗寒性油棕品種在10 ℃低溫下葉片中的ABA含量變化與番茄相同^[16]。王興等^[17]認為，強抗寒性冬小麥品種能在低溫下較長時間維持高水平的IAA含量。本試驗證明，抗寒性越弱的品種葉片中ABA含量在0 ℃處理前后的相對上升幅度越小，IAA含量在低溫處理后降幅越小，抗寒性越強。ABA/IAA值的耐寒系數(shù)與抗寒性顯著相關(guān)，證明ABA與IAA的協(xié)同作用與抗寒性也有關(guān)系，在葡萄中有相似結(jié)論，曲凌慧等^[18]認為，強抗寒性品種葉片中ABA/IAA值較高。

植物會響應(yīng)外界低溫環(huán)境從而改變內(nèi)源激素的含量^［19-23］，強抗寒性甘藍型冬油菜品種葉片中生長促進型激素含量下降幅度小于弱抗寒性品種，生長抑制型激素含量上升幅度大于弱抗寒性品種。相關(guān)性分析結(jié)果表明，低溫處理后GA₃含量的相對變化可作為抗寒性評價的穩(wěn)定指標。

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（責(zé)任編輯：張震林）