王文遞 馬蓓蓓 吳惠文

肥胖是一種復(fù)雜的多因素疾病,其特征是白色脂肪組織 (white adipose tissues,WAT) 的過度積累。據(jù)統(tǒng)計,44%的糖尿病,23%的缺血性心臟病,以及7%～41%的特定癌癥都是由肥胖引起的[1-3]。研究顯示,肥胖與脂肪組織的功能紊亂密切相關(guān),而促進WAT棕色化即褐變,成為治療肥胖等代謝疾病的新靶點[4,5]。Fisher等[6]研究表明,小鼠輸注3 d成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21),可上調(diào)脂肪組織中產(chǎn)熱基因的表達。研究同時表明,活化β3AR-G蛋白-cAMP-PKA通路,可誘導(dǎo)肝細(xì)胞FGF21表達[7]。然而,通過活化β3AR-G蛋白-cAMP-PKA通路誘導(dǎo)褐變過程中,脂肪組織FGF21蛋白的作用還不甚了解。本研究擬通過高脂飲食復(fù)制C57BL/6小鼠肥胖模型,探討活化β3AR-PKA通路促進褐變過程中,脂肪組織FGF21蛋白的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 32 只 6 周齡 C57BL/6 小鼠(購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)分別采用標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料(16 只)及 45%千卡脂肪高脂飼料(16 只)喂養(yǎng)。12 周后,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)小鼠隨機分為2組:對照組(NC組)皮下注射0.9%氯化鈉溶液,注射 CL316,243組(CL組)皮下注射CL316,243(1 mg/kg,連續(xù)注射2周);高脂飼料喂養(yǎng)小鼠隨機分為2組:高脂飲食組(HFD組)皮下注射0.9%氯化鈉溶液,高脂飲食注射 CL316,243 組(HFD+CL組)皮下注射CL316,243(1 mg/kg,連續(xù)注射2周)。14周后,腹腔注射 1%戊巴比妥鈉(75 mg/kg)麻醉,分離腹股溝白色脂肪組織(inguinal white adipose tissue,iWAT)及附睪白色脂肪組織(epididymal white adipose tissue,eWAT)稱重,取部分脂肪組織及肝組織置于4%多聚甲醛溶液固定或-80℃冷凍保存。

1.2 細(xì)胞與分組 培養(yǎng)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞,將其誘導(dǎo)成熟后分為4組:NC組,DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);CL組,培養(yǎng)液+10 μmol/L CL316,243;SU組,培養(yǎng)液+50 μmol/L SU5402(特異的 FGF 受體抑制劑,提前30 min 加入);CL+SU組,培養(yǎng)液+50 μmol/L SU5402(提前30 min 加入)+10 μmol/L CL316,243。48 h后,吸取細(xì)胞上清液,消化離心收取脂肪細(xì)胞于-40℃冷凍保存。

1.3 主要試劑 3T3-L1前脂肪細(xì)胞系購自武漢博士德生物工程有限公司;過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC-1α)及解偶聯(lián)蛋白 1(uncoupling protein 1,UCP1)一抗購自武漢ABclonal公司;成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast Growth Factor 21,FGF21)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)一抗及SU5402購自上海覓拓生物科技有限公司。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 病理學(xué)檢測:取4%多聚甲醛溶液固定的肝組織及脂肪組織,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色,光鏡下觀察其病理學(xué)變化。

1.4.2 Western blot檢測:組織或細(xì)胞樣本,加入適量RIPA及PMSF于冰上裂解,4℃ 13 000 r/min離心10 min,取上清 BCA 法定量并調(diào)整蛋白濃度,蛋白樣品變性后,10% SDS-PAGE 電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)印,5%BSA或脫脂奶粉封閉2 h,加抗體4℃過夜孵育,TBST洗滌3次,10 min/次,加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,室溫孵育90 min,洗滌3次,滴加ECL發(fā)光液,采用FluorChem凝膠成像系統(tǒng)采集并分析關(guān)鍵蛋白表達。

1.4.3 細(xì)胞線粒體免疫熒光:干預(yù)后的3T3-L1脂肪細(xì)胞去除細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS洗滌3次,加入20 nmol/L 預(yù)孵育的Mito-Tracker Green工作液,與細(xì)胞37℃共孵育 45 min。去除Mito-Tracker Green 工作液,洗滌2次,加入 37℃預(yù)孵育的新鮮培養(yǎng)基 0.5 ml。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 22.0及Graph Pad Prism 6統(tǒng)計軟件,組間均數(shù)比較采用t檢驗,體重變化數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量分析,其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在體實驗

2.1.1 小鼠一般狀況:與NC組比較,HFD組小鼠體重于3周后開始增高(P<0.05),給小鼠注射β3-AR 激動劑后,CL組小鼠體重下降(P<0.01)。HFD 組小鼠iWAT 和 eWAT 顯著高于NC組(P<0.001)。見圖1,表1、2。

表1 注射 CL316,243 后小鼠體重變化n=8,g,

表2 小鼠iWAT 和 eWAT 變化 n=8,g,

圖1 小鼠體重變化

2.1.2 脂肪組織病理學(xué)變化:與NC組比較,CL組小鼠脂肪細(xì)胞形態(tài)由單房脂滴向多房脂滴;但與HFD組比較,HFD+CL組小鼠脂肪細(xì)胞并未發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化。見圖2。

圖2 附睪白色脂肪組織HE染色(×200)

2.1.3 肝組織病理學(xué)變化:光鏡下觀察肝組織及脂肪組織,結(jié)果顯示,NC組肝臟呈暗紅色,無油膩感,鏡下可見肝細(xì)胞形態(tài)正常,肝索呈放射狀排列;HFD組肝臟呈淡黃色,切面有明顯油膩感,鏡下可見肝細(xì)胞腫脹,包漿內(nèi)有脂滴空泡。見圖3。

圖3 肝組織HE染色(×200)

2.1.4 Western blot結(jié)果:與NC組比較,CL組PKA、FGF21、PGC-1α及UCP1表達明顯增加(P<0.05);與CL組比較,HFD+CL組PKA及棕色化相關(guān)蛋白表達降低(P<0.05);與HFD組比較,HFD+CL組相關(guān)蛋白表達有所升高(P<0.05)。見圖4,表3。

表3 iWAT中PKA及棕色化相關(guān)蛋白表達的相對灰度值n=3,

圖4 圖4 iWAT中PKA、FGF21、UCP1及PGC-1α表達

2.2 體外實驗

2.2.1 Western blot結(jié)果:與NC組比較,CL組和SU+CL組PKA表達增加(P<0.001),與CL組相比,SU+CL組棕色化相關(guān)蛋白表達降低(P<0.05)。見圖5,表4。

表4 SU5402對CL316,243誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞中PKA及棕色化相關(guān)蛋白表達的相對灰度值

圖5 SU5402對CL316,243誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞中PKA、FGF21、UCP1及PGC-1α表達的影響

2.2.2 細(xì)胞線粒體免疫熒光結(jié)果:3組細(xì)胞處理后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中線粒體情況,與NC組比較,CL組線粒體表達明顯增多;相較于CL組,SU+CL組線粒體表達明顯減少。見圖6。

圖6 細(xì)胞免疫熒光檢測 3T3-L1 脂肪細(xì)胞線粒體表達(×200)

3 討論

本研究通過高脂飲食復(fù)制C57BL/6小鼠肥胖模型,造模成功后,可見HFD組小鼠體重、iWAT 和 eWAT均明顯增加,HE染色后光鏡下可見肝細(xì)胞包漿內(nèi)有脂滴空泡,伴有氣球樣變,且脂肪細(xì)胞增大。同時發(fā)現(xiàn),給小鼠注射CL316,243后,CL 組小鼠體重下降,并且HE 染色結(jié)果顯示脂肪細(xì)胞形態(tài)由單房脂滴向多房脂滴轉(zhuǎn)變。

FGF21是由包括脂肪組織在內(nèi)的多種器官合成的一種多效性蛋白,可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)、糖代謝以及脂肪因子的分泌等,在能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[8,9]。研究表明,冷暴露及β3AR刺激可以增加FGF21在棕色脂肪組織(brown adipose tissues,BAT)以及肝臟中的表達[10,11]。本實驗結(jié)果顯示,高脂誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肥胖時,WAT中FGF21表達下降,在注射CL316,243后,FGF21表達顯著升高。表明,激活β3AR-PKA通路,可以上調(diào)WAT中FGF21的表達。PGC-1α是 PPARγ的輔激活因子,是調(diào)控機體能量代謝的重要基因。Ringholm等[12]研究表明,增加 WAT 中 PGC-1α表達和活性,有助于誘導(dǎo) UCP1 表達。UCP1是一種線粒體內(nèi)膜蛋白,具有質(zhì)子漏的功能,可促進電子傳遞鏈泵出的氫離子直接流回線粒體內(nèi)膜,降低線粒體膜電位,限制ATP合成,增加產(chǎn)熱。業(yè)已證實,UCP1的過表達可以促進WAT棕色化,增加能量消耗并預(yù)防小鼠肥胖。本實驗結(jié)果顯示,HFD組小鼠iWAT中PGC-1α及UCP1表達降低,在注射CL316,243后得到顯著改善。體外實驗,FGF21受體被抑制后,脂肪細(xì)胞PGC-1α及UCP1表達顯著下降。Abu-Odeh等[13]研究亦表明,小鼠FGF21特異性受體敲除,會導(dǎo)致WAT中褐變相關(guān)基因PGC-1α及UCP1的表達減弱。由此推測,激活β3AR-PKA通路,可以上調(diào)WAT中FGF21的表達,增加PGC-1α及UCP1的表達。

線粒體作為細(xì)胞的“能量工廠”,對于細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的維持具有重要意義。研究表明,PGC-1α可以調(diào)控多種細(xì)胞線粒體的生物合成過程[14]。Kleiner等[15]研究顯示,脂肪組織特異性缺乏PGC-1α?xí)抡{(diào)產(chǎn)熱基因以及線粒體基因的表達。體外實驗顯示,CL316,243可以誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞線粒體的表達,但在FGF21受體被抑制后明顯減少?？梢?β3AR激動劑在誘導(dǎo)褐變過程中,FGF21發(fā)揮著重要作用。

綜上所述,通過激活β3AR-PKA通路,可增加WAT中FGF21分泌,進而上調(diào)PGC-1α及UCP1表達,促進WAT棕色化。