謝婷 楊棟 羅銀利 郭育君 王杜

慢性失眠是指睡眠障礙持續(xù)>6個月,其特征為無法入睡或無法保持睡眠狀態(tài),導(dǎo)致睡眠不足。研究顯示,失眠是引起認(rèn)知功能障礙的重要原因之一,尤其是老年人其認(rèn)知功能損傷的風(fēng)險增加了近2倍,目前對失眠引起認(rèn)知功能障礙的發(fā)病原因及機制尚不清楚[1]。中醫(yī)認(rèn)為慢性失眠認(rèn)知功能障礙屬于“不寐、癡呆”范疇,腦髓空虛是本病的基本病理變化,腎精虧虛是其基本病機[2]。研究表明,腎虛患者大多腦功能下降,大腦神經(jīng)細(xì)胞減少、內(nèi)分泌功能紊亂、炎性因子和變態(tài)反應(yīng)增加[3,4]。慢性失眠作為原發(fā)病在中醫(yī)病機以陰虛為本,尤以腎陰虛為突出證候特點,其基本病機是“腎陰不足、腦虛髓減”,臨床上從“陰虛”論治療該病效果顯著[5,6]。左歸丸為滋腎補陰的代表方劑,其所含的熟地、山藥、山萸肉、枸杞子、菟絲子、鹿角膠六味藥以甘溫性味為重,是填精補腎之上品。研究顯示左歸丸具有很好的的神經(jīng)保護作用[6,7]。因此,本研究從2021年4月開始,進行為期9周的試驗。擬構(gòu)建睡眠剝奪大鼠模型并給予左歸丸干預(yù),探討左歸丸對睡眠剝奪大鼠所致認(rèn)知障礙的保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 D-半乳糖(上海試劑二場),左歸丸(北京同仁堂股份有限公司),0.3 g/ml戊巴比妥鈉 (上海新亞藥業(yè)有限公司),丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)以及BCA蛋白檢測試劑盒均購自南京建成科技有限公司,大鼠白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司?？笽L-6、抗IL-1β、抗TNF-α、抗NF-κB和抗GAPDH等一抗購自英國Abcam公司,羊抗兔二抗IgG購自上海易利生物科技有限公司。

1.2 動物模型制備及分組 從西斯貝福生物科技有限公司購買40只健康無特定病原體(SPF)級的、體重200 g左右的遠(yuǎn)交群(SD)雄性大鼠。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機數(shù)字法分為5組,每組8只。采用多平臺水環(huán)境法構(gòu)建睡眠剝奪模型[7],自制睡眠剝奪箱,規(guī)格1 m × 0.8 m × 0.4 m,將多個圓形小平臺置于睡眠剝奪箱內(nèi),箱內(nèi)注水至水面高出平臺1 cm,使大鼠可以在平臺站立及自由攝食、飲水,在大鼠進入快速眼動睡眠階段后,會因為骨骼肌松弛掉入水中而驚醒,造成睡眠剝奪,12 h/d,連續(xù)4周。造模成功后,分為:對照組:每日灌胃等量的0.9%氯化鈉溶液;模型組:每日灌胃等量的0.9%氯化鈉溶液;左歸丸低劑量組:每日灌胃左歸丸水溶液0.9 g/kg;左歸丸中劑量組:每日灌胃左歸丸水溶液1.8 g/kg;左歸丸高劑量組:每日灌胃左歸丸水溶液3.6 g/kg;1次/d,連續(xù)4周。

1.3 水迷宮實驗 Morris 水迷宮分為空間探索實驗及定位巡航實驗,實驗設(shè)備由圓形水池(直徑120 cm,高60 cm)、可移動大鼠站臺 (直徑10 cm,高30 cm)、影像收集及分析系統(tǒng)等部分組成。實驗時圓形水池水面需沒過大鼠站臺1～2 cm,水池分成 4 個象限, 將站臺放入第一象限定為目標(biāo)象限。Morris水迷宮共進行 7 d,前 5 d為空間探索實驗,將大鼠從第三象限的中間點面朝著水池的池壁放入到水池中,如果大鼠在 60 s的時間內(nèi)未找到站臺,則將大鼠引到站臺上停留10 s,統(tǒng)計大鼠上平臺潛伏期,游泳總路程。第6天休息,第 7 天撤去平臺后開始定位航行實驗,記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間,評價睡眠剝奪和左歸丸對學(xué)習(xí)記憶的影響。

1.4 ELISA檢測 末次實驗結(jié)束后,腹主動脈取血,離心(3 500 r/min,15 min),收集血清。 檢測血液中IL-1β、IL-6以及TNF-α等炎性因子的水平。

1.5 Western blot檢測 稱取適量的海馬組織,加入裂解液500 ml (RIPA∶PMSF =100∶1),勻漿離心后取上清,使用BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。取20 μg蛋白用SDS-PAGE分離膠電泳后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入抗IL-6(1∶1 000)、抗IL-1β(1∶1 000)、抗TNF-α(1∶1 000)、抗NF-κB(1∶1 000)、抗GAPDH(1∶10 000),4℃孵育過夜。TBST漂洗3次,10 min/次,然后加入二抗羊抗兔IgG室溫孵育1 h,TBST漂洗3次,10 min/次,最后加入適量ECL化學(xué)發(fā)光液,用化學(xué)發(fā)光儀拍照使用image J對條帶進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 左歸丸對睡眠剝奪大鼠空間探查實驗的影響 與對照組比較,模型組大鼠目標(biāo)象限停留時間顯著減少(P<0.05),大鼠穿越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.05);與模型組比較,左歸丸組大鼠目標(biāo)象限停留時間顯著延長,大鼠穿越平臺次數(shù)有顯著增加,并且左歸丸的作用呈劑量相關(guān)性(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠空間探查實驗比較 n=8,

2.2 左歸丸對睡眠剝奪大鼠定位巡航實驗的影響 與對照組比較,模型組大鼠逃避潛伏期和游泳總路程顯著延長(P<0.05);與模型組比較,給予中等及高劑量的左歸丸治療后大鼠游泳總路程顯著減少(P<0.05),給予各劑量的左歸丸治療后大鼠逃避潛伏期顯著減少,而左歸丸中劑量大鼠逃避潛伏期和游泳總路程顯著減少得更顯著(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠定位巡航實驗比較 n=8,

2.3 左歸丸對睡眠剝奪大鼠血清炎性因子水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,左歸丸各給藥劑量組大鼠血清中IL-1β,IL-6以及TNF-α水平顯著降低,左歸丸中劑量大鼠炎癥水平降低最顯著(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較 n=8,pg/ml,

2.4 左歸丸對睡眠剝奪大鼠氧化應(yīng)激水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠海馬中MDA含量明顯增加,(P<0.05)GSH-Px、SOD水平降低(P<0.05);與模型組比較,左歸丸組大鼠海馬中MDA含量明顯減少(P<0.05),GSH-Px、SOD水平顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠海馬中MDA、GSH-Px以及SOD水平檢測結(jié)果 n=8,

2.5 左歸丸對睡眠剝奪大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組大鼠海馬中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,左歸丸各劑量組大鼠海馬組織中TNF-α和IL-1β的蛋白表達水平均有不同程度的下調(diào)(P<0.05),左歸丸中劑量組TNF-α的蛋白表達水平下調(diào)(P<0.05)。見圖1,表5。

圖1 5組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達水平

表5 5組大鼠海馬中中TNF-α,IL-1β和IL-6蛋白相對表達 n=8,

2.6 左歸丸對睡眠剝奪大鼠海馬組織中NF-κB蛋白表達的影響 對照組大鼠海馬中NF-κB蛋白相對表達量為(0.25±0.03),模型組為(0.43±0.04)。與對照組比較,模型組大鼠海馬中NF-κB蛋白相對表達顯著上調(diào)(P=0.003);左歸丸低、中、高組大鼠海馬中NF-κB蛋白相對表達量分別為(0.41±0.02)、(0.26±0.02)、(0.25±0.03),與模型組比較,左歸丸中、高組大鼠海馬中NF-κB蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)。

3 討論

慢性失眠現(xiàn)在已經(jīng)呈現(xiàn)發(fā)病逐漸年輕化的趨勢,研究發(fā)現(xiàn),睡眠剝奪被認(rèn)為是認(rèn)知損傷的獨立危險因素,常以記憶力減退及情感障礙為首發(fā)癥狀,但具體分子機制還不是十分明確[8-10]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性失眠的病機為陰虛為本,燥熱為標(biāo),兩者互為因果,陰愈虛則燥熱愈盛,燥熱愈盛則陰愈虛,病變臟腑主要在肺、胃、腎,以腎為關(guān)鍵。慢性失眠的發(fā)生發(fā)展與腎陰虛衰密切相關(guān)。腎為先天之本,主藏精而寓元陰元陽,腎主骨生髓,與腦髓密切相關(guān),陰虛精虧髓減,清竅失充[11,12]。本研究通過構(gòu)建大鼠睡眠剝奪模型,發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪可以顯著減少大鼠在目標(biāo)象限停留時間,延長大鼠上平臺潛伏期、游泳總路程、初次抵達平臺時間,表明睡眠剝奪會損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶;而經(jīng)左歸丸干預(yù)后可以顯著增加大鼠在目標(biāo)象限停留時間,減少大鼠上平臺潛伏期、游泳總路程、初次抵達平臺時間,該結(jié)果表明左歸丸能提高睡眠剝奪大鼠的學(xué)習(xí)記憶,對睡眠剝奪所致的認(rèn)知障礙有保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪會導(dǎo)致腦部的氧化應(yīng)激[13]。海馬在認(rèn)知功能中有著重要作用,本實驗選取海馬組織中相關(guān)蛋白表達進行分析,結(jié)果顯示睡眠剝奪會降低大鼠海馬SOD、GSH-Px的活性并產(chǎn)生過量的MDA,而給予左歸丸干預(yù)后能明顯增加SOD、GSH-Px的活性,減少MDA的含量,說明左歸丸能提高體內(nèi)抗氧化功能,降低氧化損傷,防止大分子過氧化。

有研究表明,睡眠剝奪可增加海馬IL-1β 表達,引起動物認(rèn)知功能障礙, 反復(fù)睡眠剝奪組TNF-α 的水平明顯升高,NF-κB信號途徑被激活,而NF-κB 是參與促炎因子生成的物質(zhì)[14-15]。同時也有研究表明睡眠剝奪可導(dǎo)致小鼠血清 IL-1β,IL-6以及TNF-α 細(xì)胞因子水平升高[16]。本實驗結(jié)果顯示,睡眠剝奪組大鼠IL-1β、IL-6以及TNF-α等炎性因子水平均顯著上調(diào),說明睡眠剝奪會促使促炎因子釋放,產(chǎn)生炎性反應(yīng)。而左歸丸干預(yù)后,左歸丸組大鼠與模型組比較IL-1β、IL-6、TNF-α表達都出現(xiàn)顯著下調(diào),說明左歸丸能夠改善睡眠剝奪引起的學(xué)習(xí)記憶損傷及炎性反應(yīng)。

睡眠剝奪會誘發(fā)炎性反應(yīng),NF-κB 是 TNF-α、IL-6 等炎癥基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,NF-κB 的活化會促生炎性細(xì)胞因子[17-20]。本研究表明,睡眠剝奪組大鼠NF-κB蛋白表達顯著上調(diào),說明睡眠剝奪引起了炎性反應(yīng);而左歸丸干預(yù)組大鼠海馬中NF-κB的表達下調(diào),說明左歸丸能減少NF-κB和促炎因子的表達,調(diào)控炎癥過程,改善睡眠剝奪引起的學(xué)習(xí)記憶損傷。

綜上所述,本研究通過構(gòu)建大鼠睡眠剝奪模型,證實睡眠剝奪會導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能損傷,左歸丸可能通過降低睡眠剝奪引起的相關(guān)炎性反應(yīng),增加其抗氧化功能,從而改善睡眠剝奪所致的認(rèn)知損傷。