汪瑩 申復(fù)進(jìn) 李洋 馮丹 劉婷婷 廖文欣

宮頸癌是常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近年來(lái)發(fā)病呈年輕化的趨勢(shì)[1]。隨著HPV疫苗的普及和宮頸癌篩查手段提升,患者得以早診斷早治療,但局部晚期宮頸癌患者由于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致預(yù)后不良[2]。目前,宮頸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制尚未明確,需要尋找更為合適的分子靶點(diǎn)為臨床診斷和治療提供參考依據(jù)。MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為18～25 nt非編碼小RNA,常與靶基因mRNA3’ UTR內(nèi)的部分互補(bǔ)序列結(jié)合,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平沉默靶基因功能來(lái)影響多個(gè)生物過(guò)程,包括細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等[3]。研究表明miR-20b-5p在不同腫瘤中有著促癌或抑癌的作用,其在肺癌[4]、喉癌[5]等大多數(shù)實(shí)體瘤中發(fā)揮促癌作用,而在結(jié)腸癌[6]、腎細(xì)胞癌[7]等腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。然而,miR-20b-5p在宮頸癌中的功能機(jī)制尚不明確。Qi等[8]研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中2型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體(TGFbeta type Ⅱ receptor,TGFBR2)是miR-20b-5p的靶基因,miR-20b-5p/TGFBR2/E2F1軸誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化。TGFBR2是TGF-β直接結(jié)合并發(fā)揮作用的受體,具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性[9]。TGFBR2作為TGF-β信號(hào)通路中發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子,是重要的腫瘤抑制因子[10]。研究發(fā)現(xiàn)TGFBR2在直腸癌[11]、卵巢癌[12]、肺癌[13]等實(shí)體瘤中呈低表達(dá),其表達(dá)喪失則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。Yuan等[14]研究發(fā)現(xiàn)TGFBR2在宮頸癌細(xì)胞中呈低表達(dá),其通過(guò)阻斷Hedgehog通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移。本研究探討miR-20b-5p和TGFBR2在宮頸癌組織中的表達(dá)情況及與臨床病理特征的關(guān)系,尋找宮頸癌轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)的新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年10月我院診治的宮頸癌患者58例。年齡32～65歲,平均年齡(51.52±10.33)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診為宮頸癌;(2)均未接受過(guò)化療、放療等抗腫瘤治療;(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤;(2)接受過(guò)化療、放療、免疫治療等;(3)臨床資料不完整或缺失;(4)合并重要器質(zhì)性病變。選取32例同期因子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除術(shù)的正常宮頸組織為對(duì)照組,年齡35～67歲,平均年齡(51.47±9.03)歲。2組患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn),所有患者術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)2組宮頸組織中miR-20b-5p和TGFBR2 mRNA表達(dá)水平:TRIzol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)提取組織中總RNA,使用分光光度儀檢測(cè)組織樣本RNA的純度,選用A260/A280在1.8～2.0間RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司,貨號(hào):1139ES60)說(shuō)明,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-20b-5p內(nèi)參為U6,TGFBR2內(nèi)參為GAPDH,以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。采用qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司,貨號(hào):1141ES),以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:95℃預(yù)變性2 min,1個(gè)循環(huán);95℃變性10 s,60℃退火/延伸30,40個(gè)循環(huán)。引物由上海生物工程股份有限公司合成。miR-20b-5p正向引物序列為5’-GCGCAAAGTGCTCATAGTGC-3’,反向引物序列為5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。TGFBR2正向引物序列為5’-CTTTGGGCTTTCCCTGCGT-3’,反向引物序列為5’-TGTCATTTCCCAGAGCACCAG-3’。U6正向引物序列為5 ’-AGCACATATACTAAAATTGGAA

CGAT-3’,反向引物序列為5’-ACTGCAGGGTCCGAGG

TATT-3’。GAPDH正向引物序列為5’-GGAAGCTTGT

CATCAATGGAAATC-3’,反向引物序列為5’-TGATGA

CCCTTTTGGCTCCC-3’。

1.2.2 Western blot檢測(cè)2組宮頸組織中TGFBR2蛋白表達(dá):2組宮頸組織塊用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2～3次,剪成小塊置于勻漿器中。加入RIPA裂解液(大連美侖生物技術(shù)有限公司)裂解,冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中,振蕩。冰浴30 min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保勻漿液完全裂解。4℃下13 000 g離心5 min,收集上清(蛋白)。采用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(武漢科瑞生物技術(shù)有限公司)測(cè)定樣品蛋白濃度后,在蛋白樣品中加入適當(dāng)量的5×蛋白上樣緩沖液(大連美侖生物技術(shù)有限公司),95～100℃沸水浴5 min。按檢測(cè)濃度進(jìn)行上樣,電泳分離蛋白后再轉(zhuǎn)膜,在5%脫脂牛奶中封閉1 h。加入已稀釋好的TGFBR2兔抗人單克隆抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號(hào):AF5449)4℃過(guò)夜,用TBST洗3次,5 min/次,加入稀釋好的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號(hào):GB23303),室溫孵育30 min,用TBST室溫下?lián)u床上洗4次,5 min/次。滴加ECL混合溶液(武漢科瑞生物技術(shù)有限公司),暗室中曝光。Image J軟件對(duì)蛋白定量進(jìn)行分析。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)2組宮頸組織中TGFBR2:免疫組化染色采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物技術(shù)法(SP法),將組織石蠟包埋并切片,切片在60℃烤箱內(nèi)烘烤后進(jìn)行二甲苯脫蠟, 乙醇脫水后沖洗,抗原修復(fù)、血清封閉、一抗及二抗孵育、DAB顯色液進(jìn)行顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。TGBFR2兔抗人單克隆抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號(hào):AF5449),SP試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,貨號(hào):KIT-5920)。由我院病理科醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡(200×)下盲法閱片拍照,以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色,否則為陰性表達(dá)。

1.2.4 miR-20b-5p和TGFBR2結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè):通過(guò)https://www.targetscan.org/vert_80/在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-20b-5p和TGFBR2的靶向結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 2組宮頸組織中TGFBR2蛋白表達(dá) TGFBR2在宮頸癌組中表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(t=9.24,P<0.001);TGFBR2在宮頸癌組中表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(t=13.27,P<0.01)。見(jiàn)圖1,表1。

表1 2組TGFBR2蛋白表達(dá)水平

圖1 宮頸癌組和對(duì)照組宮頸組織中TGFBR2蛋白表達(dá)情況;A Western blot檢測(cè)TGFBR2蛋白表達(dá)及量化分析;B 免疫組化染色檢測(cè)對(duì)照組中TGFBR2的表達(dá)情況(×200);C 免疫組化染色檢測(cè)宮頸癌組中TGFBR2的表達(dá)情況(×200)

2.2 2組宮頸組織中miR-20b-5p和TGFBR2 mRNA表達(dá)情況 宮頸癌組中miR-20b-5p表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(t=10.81,P<0.01),而TGFBR2 mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(t=10.19,P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 2組宮頸組織中miR-20b-5p、TGFBR2 mRNA的表達(dá)情況

2.3 miR-20b-5p和TGFBR2 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析 通過(guò)Targetscan在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-20b-5p和TGFBR2基因的靶向結(jié)合位點(diǎn),顯示miR-20b-5p與TGFBR2的3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn),Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中miR-20b-5p與TGFBR2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.7366,P<0.0001)。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-20b-5p和TGFBR2 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析;A miR-20b-5p和TGFBR2的靶向結(jié)合位點(diǎn);B 宮頸癌組織中miR-20b-5p與TGFBR2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

2.4 miR-20b-5p、TGFBR2表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)miR-20b-5p和TGFBR2表達(dá)水平的均值將宮頸癌患者分為miR-20b-5p低表達(dá)組、miR-20b-5p高表達(dá)組、TGFBR2低表達(dá)組和TGFBR2高表達(dá)組。發(fā)現(xiàn)miR-20b-5p表達(dá)水平與宮頸癌患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(均P<0.05),與年齡、病理類型、分化程度、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。TGFBR2表達(dá)水平與宮頸癌患者的分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),與年齡、病理類型、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 miR-20b-5p、TGFBR2表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

3 討論

高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)因素,嚴(yán)重?fù)p害女性生命健康[15]。近年來(lái)早期宮頸癌治療效果較好,但局部晚期宮頸癌由于轉(zhuǎn)移或化療耐藥等導(dǎo)致臨床治療效果不理想。因此,進(jìn)一步探索宮頸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制,尋找潛在的干預(yù)靶點(diǎn),對(duì)提高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性宮頸癌的治療效果至關(guān)重要。

隨著對(duì)miRNA相關(guān)研究的深入,miRNA通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因mRNA的表達(dá)以影響細(xì)胞的增殖、侵襲等生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在肺癌[16]、乳腺癌[17]等多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá),與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、耐藥性及預(yù)后密切相關(guān)。miR-20b-5p來(lái)源于miR-17基因家族,先前已被報(bào)道參與肺癌[18]、結(jié)直腸癌[19]等實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等。據(jù)研究表明,在肝細(xì)胞癌(HCC)組織中miR-20b-5p呈顯著高表達(dá),過(guò)表達(dá)的miR-20b-5p通過(guò)靶向下調(diào)胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白3(CPEB3)表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[20]。miR-20b-5p在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá),miR-20b-5p通過(guò)雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)和E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F1)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲并抑制凋亡[21]。miR-20b-5p在HCC和乳腺癌中呈高表達(dá),在其腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促癌基因功能。本研究結(jié)果顯示,宮頸癌組織中miR-20b-5p表達(dá)量顯著高于正常宮頸組織(P<0.001),提示miR-20b-5p可能在宮頸癌中發(fā)揮促癌因子作用,參與調(diào)控宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Yu等[22]研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)組織中miR-20b-5p表達(dá)顯著高于鄰近食管正常組織,miR-20b-5p表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期ESCC分期呈顯著相關(guān)(P<0.05)。Pantazis等[23]研究發(fā)現(xiàn)在喉鱗狀細(xì)胞癌中miR-20b-5p高表達(dá)的患者較miR-20b-5p低表達(dá)的患者更容易復(fù)發(fā),且低表達(dá)miR-20b-5p的患者預(yù)后更好。與上述研究結(jié)果相似,本研究通過(guò)分析miR-20b-5p和宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系顯示,miR-20b-5p表達(dá)水平與宮頸癌患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05),與年齡、病理類型、分化程度、腫瘤大小無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05),可見(jiàn)miR-20b-5p可能參與晚期宮頸癌的淋巴轉(zhuǎn)移。

TGFBR2是TGF-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子,其編碼基因位于3p22。已有研究報(bào)道TGFBR2在非小細(xì)胞肺癌[24]、胃癌[25]等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌因子作用,抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Yuan等[26]研究發(fā)現(xiàn)與正常宮頸上皮細(xì)胞相比,TGFBR2在宮頸癌細(xì)胞系(HeLa、SiHa、CaSk、C33A)中呈低表達(dá),但在宮頸癌組織的表達(dá)情況尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,宮頸癌組織中TGFBR2的表達(dá)量顯著低于正常宮頸組織(P<0.001),提示TGFBR2可能參與宮頸癌發(fā)展,發(fā)揮抑癌因子作用。本研究通過(guò)分析TGFBR2表達(dá)水平與宮頸癌患者的臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)TGFBR2表達(dá)與宮頸癌患者的分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05),與年齡、病理類型、腫瘤大小無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05),提示TGFBR2低表達(dá)可能與宮頸癌增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。根據(jù)Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TGFBR2和miR-20b-5p具有靶向結(jié)合位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,宮頸癌組織中miR-20b-5p與TGFBR2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.7366,P<0.01)。這提示miR-20b-5p與TGFBR2可能存在靶向調(diào)控關(guān)系共同參與宮頸癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程。

綜上所述,在宮頸癌組織中miR-20b-5p呈高表達(dá),TGFBR2呈低表達(dá),兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。miR-20b-5p、TGFBR2表達(dá)水平與宮頸癌FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),為評(píng)估宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后提供參考價(jià)值。