周宇 殷雪瑞 陳思宇

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率分別占全部惡性腫瘤的20.03%和26.99%,居惡性腫瘤的首位[1]。肺癌早期癥狀隱匿,超過80%患者就診時(shí)已處于中晚期,手術(shù)、放療、化療等治療效果不理想[2]。目前,肺癌診斷主要依賴于病理學(xué)和和影像學(xué)。美國國立肺篩查試驗(yàn)(national lung screening trial,NLST)建議無癥狀肺癌高危人群每年應(yīng)進(jìn)行低劑量CT檢查[3],但是CT檢查成本較高,推廣難度大,而且常規(guī)CT篩查難以有效鑒別部分肺結(jié)節(jié)和較小的肺部腫瘤;而病理學(xué)診斷為有創(chuàng)檢查,患者依從性不高,樣本取材受限[4]。血清腫瘤標(biāo)志物具有快速、便捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),已成為腫瘤輔助診斷研究的熱點(diǎn)。臨床常用的肺癌血清標(biāo)志物主要有癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(nueron-specific enolase,NSE)、細(xì)胞角蛋白片段19(cytokeratin 19-fragments,CYFRA21-1)等,但是上述指標(biāo)在其他惡性腫瘤和非腫瘤疾病中也常存在異常表達(dá),用于診斷肺癌的特異性和敏感性均不高[5,6]。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一類高度保守的非編碼單鏈RNA,長度約為22個(gè)核苷酸,參與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展[7]。研究證實(shí),肺癌患者血清或血漿中miRNA含量變化與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),有成為肺癌輔助診斷標(biāo)志物的潛能[8]。本研究前期對基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO)進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)miR135a-5p在胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌中均存在異常表達(dá),但是其在肺癌患者中的表達(dá)情況尚未見報(bào)道。因此,本研究通過檢測血清miR135a-5p在肺癌患者中的表達(dá)水平。分析其對肺癌及其不同病理分型的輔助診斷價(jià)值,旨在為肺癌早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年4月至2020年2月在我院住院治療的115例肺癌住院患者作為肺癌組,男74例,女41年;27～78歲,平均年齡(53.9±8.4)歲;選取同期醫(yī)院收治的肺部良性疾病患者100例作為良性組,男67例,女33例;年齡23～74歲,平均年齡(52.7±10.5)歲;包括肺炎41例,慢性阻塞性肺疾病30例,間質(zhì)性肺炎8例,哮喘11例,支氣管擴(kuò)張合并感染6例,肺膿腫4例。同時(shí)選擇在醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的100例體檢者作為對照組,男70例,女30例;年齡19～78歲,平均年齡(53.1±7.4)歲。良性組和對照組均明確排除惡性腫瘤史或惡性腫瘤高危人群。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為肺癌;臨床資料完整;首次在本院進(jìn)行治療;無其他惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn):嚴(yán)重肝腎功能不全或自身免疫性疾病。

1.3 方法 3組均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周靜脈血5 ml,4℃下16 000×g離心10 min,取上清液置于離心管中,-80℃保存待用。取400 μl上清液,采用miRNA血清/血漿提取試劑盒提取血清總RNA,微量分光光度計(jì)測量其濃度和純度。采用美國賽默飛逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系:miRNA 8 μl、反應(yīng)緩沖液4 μl、逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl、逆轉(zhuǎn)錄引物1 μl、脫氧核糖核酸和核糖核酸酶抑制劑各1 μl,純水補(bǔ)足至總反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)體系充分混勻,瞬間離心。反應(yīng)條件:42℃ 60 min,95℃ 2 min,4℃ 5 min。合成的cDNA于-20℃冰箱保存待用。采用生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成的miR135a-5p以及U6內(nèi)參、羅氏公司PCR反應(yīng)混合物(FastStart Universal SYBR Green Ⅰ Master)和美國ABI公司QuantStudio 5 熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR檢測。miR135a-5p基因正向引物序列:5′-AGAGTGCAGCTCCGCTCGATTCTACTTCGA-3′,反向序列:5′-TCCTCTGCTCCACTGC-3′。U6基因正向引物序列:5′-GCAAGATAGACACAACATTACG-3′,反向序列:5′-TCGAAGCGTTGAGCAATTTCGC-3′。反應(yīng)體系:SYBR Green Ⅰ Master 10 μl,cDNA 5 μl,正、反向引物各0.5 μl,純化水3 μl,充分混勻后瞬時(shí)離心。反應(yīng)條件:94℃ 10 min,60℃ 34 s,72℃ 34 min,共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本同時(shí)設(shè)有3個(gè)復(fù)孔,取平均值。采用相對定量法計(jì)算血清miR135a-5p相對含量,以U6作為內(nèi)參,2-△△Ct作為其相對表達(dá)量,△△Ct=實(shí)驗(yàn)組(CtmiR135a-5p-CtU6)-對照組(CtmiR135a-5p-CtU6)。血清腫瘤標(biāo)志物檢測:采用羅氏診斷公司的E601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑盒檢測血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平,檢測操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,由于血清標(biāo)志物均不符合正態(tài)分布,因此采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)描述。2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),3組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),之后兩兩比較采用Dunn-Bonferroni 檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析評價(jià)血清miR135a-5p含量與CEA、NSE、CYFRA21-1的關(guān)系,使用受試者工作曲線(ROC)評價(jià)各指標(biāo)的診斷效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組血清miR135a-5p含量和腫瘤標(biāo)志物水平比較 3組血清miR135a-5p含量和腫瘤標(biāo)志物水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩兩比較:肺癌組血清CEA、NSE、CYFRA21-1、miR135a-5p高于良性組和對照組,良性組血清CEA、NSE、CYFRA21-1又高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但良性組和對照組血清miR135a-5p含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組血清miR135a-5p含量和腫瘤標(biāo)志物水平比較 M(P25,P75)

2.2 肺癌患者血清miR135a-5p含量與其臨床病理特征的關(guān)系 血清miR135a-5p含量與年齡、腫瘤最大徑無關(guān)(P>0.05),與病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 血清miR135a-5p含量與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 肺癌患者血清miR135a-5p含量與其他腫瘤標(biāo)志的相關(guān)性 肺癌患者血清miR135a-5p含量與CEA、NSE、CYFRA21-1均無相關(guān)性(r=0.019,P=0.843;r=0.025,P=0.791;r=0.100,P=0.287)。見圖1。

圖1 肺癌患者血清miR135a-5p含量與CEA、NSE、CYFRA21-1的相關(guān)性;A miR135a-5p含量與CEA的相關(guān)性;B miR135a-5p含量與NSE的相關(guān)性;C miR135a-5p含量與CYFRA21-1的相關(guān)性

2.4 血清miR135a-5p與其他腫瘤標(biāo)志物對肺癌的輔助診斷價(jià)值 診斷肺癌、肺鱗癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌曲線下面積(area under curve,AUC)最大的單項(xiàng)指標(biāo)分別為miR135a-5p(0.785)、CYFRA21-1(0.658)、CYFRA21-1(0.696)、miR135a-5p(0.762),血清miR135a-5p聯(lián)合其他腫瘤標(biāo)志物診斷肺癌、肺鱗癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌的AUC為0.849、0.647、0.748、0.773,除肺鱗癌外,聯(lián)合檢測的AUC均高于單項(xiàng)檢測。見表3,圖2。

圖2 血清miR135a-5p和腫瘤標(biāo)志物診斷肺癌的ROC曲線;A 肺癌組;B 肺鱗癌組;C 肺腺癌組;D 小細(xì)胞肺癌組

表3 血清miR135a-5p與其他腫瘤標(biāo)志物診斷肺癌的效能

3 討論

發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物是肺癌早期診斷、治療指導(dǎo)、病情監(jiān)測的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn),miRNA可在血液中長期穩(wěn)定存在,當(dāng)發(fā)生惡性病變時(shí),某些miRNA含量可發(fā)生變化,提示miRNA可能與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[9]。同時(shí),miRNA取材方便,可用于連續(xù)監(jiān)測,是一種理想的腫瘤血清標(biāo)志物。miR135a-5p屬于RNA-135家族成員,其位于第3號染色體(p21.1)[10]。關(guān)于miR135a-5p的作用現(xiàn)有研究存在爭議,王欽君等[11]認(rèn)為miR135a-5p在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高,高表達(dá)miR135a-5p與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較差分化程度有關(guān)。宋仕軍等[12]則證實(shí)miR135a-5p在胰腺癌組織中低表達(dá),上調(diào)miR135a-5p表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和增強(qiáng)化療敏感性。由此可見,miR135a-5p在不同類型惡性腫瘤中表達(dá)和作用并不一樣。本研究結(jié)果顯示,肺癌患者血清miR135a-5p含量明顯高于良性組和對照組,提示miR135a-5p在肺癌的發(fā)生和進(jìn)展中可能起到促進(jìn)作用。殷玉敬等[13]也證實(shí),促癌基因circUBAP2通過作用于靶基因miR-135b-3p,介導(dǎo)肺癌細(xì)胞體外增殖和侵襲,抑制miR-135b-3p表達(dá)有利于促進(jìn)腫瘤凋亡,與本研究結(jié)果相近。

血液miRNA含量的改變可以間接反映體內(nèi)病理過程,因此,miRNA可能與腫瘤患者臨床病理特征有關(guān)。本研究顯示,血清miR135a-5p含量與病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)。在肺癌的3種病理類型中,肺腺癌和小細(xì)胞肺癌血清miR135a-5p含量明顯升高。可能原因是肺腺癌和小細(xì)胞肺癌更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移,增加了腫瘤細(xì)胞將具有促癌作用的miR135a-5p釋放至血液的機(jī)會(huì),導(dǎo)致血清miR135a-5p表達(dá)水平異常升高[14-15]。

在臨床分期中,晚期患者血清miR135a-5p有升高的趨勢,這是因?yàn)槟[瘤晚期的患者抑癌基因表達(dá)受到抑制,原癌基因表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致腫瘤組織產(chǎn)生大量miR135a-5p并釋放入血。這也提示,監(jiān)測血清miR135a-5p有利于評估肺癌患者的病情進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn),肺癌患者血清miR135a-5p含量與CEA、NSE、CYFRA21-1等表達(dá)均無相關(guān)性,與張夢等[16]報(bào)道結(jié)論一致。黃聲凱等[17]報(bào)道稱miRNA不同于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物,其性質(zhì)更穩(wěn)定,在診斷疾病中更適用于與傳統(tǒng)指標(biāo)聯(lián)合檢測。

不同病理類型患者ROC曲線分析結(jié)果顯示,在肺癌、小細(xì)胞肺癌中miR135a-5p單獨(dú)檢測的AUC高于其他三種腫瘤標(biāo)志物,而將血清miR135a-5p聯(lián)合CEA、NSE、CYFRA21-1可以提高肺癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌的診斷效能,從而為患者贏得早期診斷和治療的機(jī)會(huì)。黃俊婷等[18]在研究中也證實(shí),miR135a-5p與糖類抗原125(CA125)聯(lián)合檢測診斷乳腺癌的靈敏度、特異度和陰性預(yù)測值均升高,可以作為乳腺癌篩查和病情預(yù)測的監(jiān)測指標(biāo)。

關(guān)于miR-135a-5p作用機(jī)制目前研究較少,現(xiàn)有證據(jù)提示其可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路,介導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。但是本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),無論miR-135a-5p單項(xiàng)檢測還是聯(lián)合其他指標(biāo),對肺鱗癌的診斷效能均不高。分析原因,可能是肺鱗癌的惡性程度較肺腺癌和小細(xì)胞肺癌稍低,在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中釋放miR-135a-5p等促癌基因偏少[20],使其在早期發(fā)病過程中不易檢測,診斷效能也偏低。

綜上所述,肺癌患者血清miR-135a-5p水平升高,其與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測可提高肺癌及其不同病理類型的診斷效能。但是本研究有以下不足:(1)本研究僅納入了肺腺癌、肺鱗癌和小細(xì)胞肺癌等3種病理類型肺癌患者,尚無法評價(jià)其對其他肺癌病理類型的診斷價(jià)值。(2)納入樣本量偏少,尚無法明確miR-135a-5p對肺鱗癌的診斷價(jià)值,miR-135a-5p在肺鱗癌中的作用仍需要進(jìn)一步探討。