朱玉光 方麗佳 黃素玲

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性自身免疫性疾病,其特征是存在自身抗體、持續(xù)的滑膜炎和全身炎癥[1-3],可導致關節(jié)破壞和殘疾,患病率為0.5%～1%[4-6]。RA各種自身抗原已被證明是滑膜T細胞的靶標,并且自身抗體存在于患者的血清和滑液中[7-9]。在RA發(fā)展過程中已檢測到幾種自身抗體,例如RA患者的血清和滑液中的類風濕因子,具有良好的敏感性(75%～90%),但特異性較差(40%)[10-12]。高度特異性的自身抗體(98%)被稱為抗瓜氨酸蛋白/肽自身抗體(ACPA)。瓜氨酸殘基是通過肽基-精氨酸脫亞胺酶(PAD)催化的精氨酸的翻譯后修飾產生的。這種修飾改變了蛋白質的抗原性。據(jù)報道,幾種瓜氨酸化自身抗原,包括纖維蛋白原、波形蛋白和α-烯醇化酶(α-enolase,ENO1),是RA患者滑膜組織中ACPA的靶抗原[13,14]。ENO1是一種主要的自身抗原。早期RA患者的血清中發(fā)現(xiàn)了針對ENO1的自身抗體。ENO1是一種高度保守的糖酵解酶,是一種多功能蛋白,在細胞表面表達時也起到纖溶酶原受體的作用,這表明它可能在RA病理生理學中纖溶系統(tǒng)的調節(jié)中發(fā)揮重要作用[15-17]。CD14最初被表征為膜相關糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白和存在于單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞上的細胞表面分化標志物,在其中它充當脂多糖(LPS)的受體。由于CD14缺乏跨膜結構域,無法自行啟動信號反應。與CD14結合的LPS被轉移到Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)-髓樣分化因子2(MD-2)復合物,隨后在其中傳遞細胞內信號。TLR4是Toll樣受體家族的成員。其下游信號通路包括NF-κB和MAPKs。NF-κB是促炎基因表達的重要調節(jié)因子,如腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin,IL-6)、IL-8,并在在炎癥調節(jié)中起關鍵作用。MAPK家族蛋白,包括哺乳動物中的細胞外信號調節(jié)激酶、c-Jun N末端激酶(JNK)和p38,與RA發(fā)病機制密切相關。JNK調節(jié)基質金屬蛋白酶(MMP)的表達及滑膜細胞的增殖、遷移和侵襲以及關節(jié)的破壞。P38對RA發(fā)病機制至關重要,因為它的激活涉及RA相關病理的幾乎所有方面,包括促炎細胞因子的表達、滑膜炎、軟骨退化、骨破壞和血管生成。本研究旨在探究可溶性ENO1通過CD14依賴性TLR4信號通路激活單核細胞并影響RA進展的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗小鼠 32只5～6周齡的雄性DBA/1小鼠購自江蘇西山中科實驗動物有限公司[動物合格證號SCXK(蘇)2023-0001]。小鼠可以自由獲取食物和水。所有動物護理程序遵循中國科學技術部《實驗動物護理和使用指南》。本研究中使用的動物實驗方案經(jīng)實驗動物管理與倫理委員會批準。

1.2 RA小鼠模型的建立 在第0天,將100 μl 牛Ⅱ型膠原(BⅡC)和弗氏完全佐劑(CFA)的乳液(含有100 μg BIIC)皮下注射到每只小鼠尾巴的基部,對照組除外。RA中度組和RA重度組在初次免疫后7 d進行BIIC和IFA乳液的加強注射。RA重度組在加強注射后7 d進行BIIC和IFA乳液的再次加強注射,21 d處死小鼠。

1.3 分組 適應實驗室條件7 d后,將所有小鼠隨機分為4組:對照組(標準條件下飼養(yǎng)的小鼠,皮下注射0.9%氯化鈉溶液),RA輕度組(第0天皮下注射BIIC)、RA中度組(第0和7天皮下注射BIIC)和RA重度組(第0、7和14天皮下注射BII),每組8只。

1.4 方法

1.4.1 關節(jié)炎嚴重程度評估:使用已建立的每爪0～4分的宏觀評分系統(tǒng)在第21天評估關節(jié)炎的嚴重程度。評分如下:0分,正常關節(jié);1分,一個關節(jié)腫脹(腳趾/手腕/腳踝/小徑);2分,不止一個關節(jié)腫脹;3分,所有關節(jié)腫脹;4分,皮膚破裂、功能障礙或關節(jié)變形。每只小鼠四只爪子的累積分數(shù)用作關節(jié)炎指數(shù),以代表整體疾病嚴重程度和進展。

1.4.2 蘇木精和伊紅(HE)染色:滑膜組織的石蠟切片用H&E染色。右后肢標本用10%(V/V)中性甲醛溶液固定24 h,包埋在石蠟中,切成4 μm厚的組織切片。根據(jù)先前描述的方案進行HE染色。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗:在第21天,所有小鼠通過CO2窒息實施安樂死。立即采集血樣,在室溫下自然凝固1 h,4℃下以3 000×g離心10 min。用ELISA試劑盒測定上清液(血清)的ENO1、CD14和TLR4表達水平。在SPARK酶標儀(Tecan公司,瑞士)上測定450 nm波長處的吸光度。

1.4.4 定量實時 PCR:從小鼠滑膜組織制備總RNA并用作第一鏈cDNA合成的模板。使用QuantStudio 6系統(tǒng)(ABI公司,美國)進行定量實時 PCR 分析。反應混合物包含 10 μl SYBR Green Master Mix、0.4 μl ROX Reference Dye(50×)、1 μl cDNA、0.4 μl正向和反向引物(10 μmol/L)和 7.8 μl無 RNase 水。擴增方案如下:在 95℃下 10 min的初始變性步驟,40 個三步循環(huán),包括變性步驟(95℃,15 s),退火步驟(60℃,60s),和一個延伸步驟 (72℃,15 s)。實驗結果采用 2-ΔΔCt法計算。

1.4.5 蛋白質印跡:冷凍的滑膜組織在冰上含有 1 mmol/L 原釩酸鈉和 1 mmol/L PMSF 的冷 RIPA解緩沖液中均質化。將勻漿在 4℃ 下以 13 000 × g 離心 10 min以去除碎片。上清液的總蛋白濃度用 BCA 法定量。通過 12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(40 μg)并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜用 5% (W/V) 脫脂奶粉在 Tris 緩沖鹽水 Tween 20 (TBST,10 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,pH值7.4,0.5% Tween 20) 中封閉 1.5 h,與初級針對小鼠的抗體,包括GAPDH (1∶10 000)、ICAM-1(1∶2 000)、MCP-1 (1∶1 000)、CCL3 (1∶1 000)、NF-κB p-p65 (1∶800)、p-JNK (1∶1 000)和MAPK p-p38 (1∶1 000),在 4℃下過夜。用 TBST (3×10 min) 洗滌后,將膜與 HRP 標記的山羊抗小鼠或抗兔二抗 (1∶1 000) 在室溫下孵育1.5 h。蛋白質條帶根據(jù)制造商的說明用 ECL 檢測試劑顯色,并暴露于 X 射線膠片。使用 Image Lab 3.0 (Bio-Rad,Hercules,CA,美國) 分析抗體反應條帶的強度水平。

1.4.6 細胞增殖試驗:使用細胞增殖 ELISA(BrdU;Roche,Basel)測定增殖,并使用酶標儀(Bio-Rad,Hercules,CA)測量 450 nm 處的光密度。

2 結果

2.1 4組關節(jié)炎指數(shù)評分比較 通過關節(jié)炎指數(shù)評分系統(tǒng)在第 21天評估關節(jié)炎的嚴重程度,結果顯示RA組關節(jié)炎指數(shù)評分較對照組升高(P<0.05),隨RA進展增加,關節(jié)炎指數(shù)評分升高(P<0.05)。見表1,圖1。

圖1 不同處理組右后肢

表1 4組關節(jié)炎指數(shù)評分比較 n=8,分,

2.2 滑膜細胞增殖隨RA進展激活 通過HE 染色檢測滑膜組織,結果顯示RA輕度組滑膜組織結構乎正常,RA中度組和RA重度組中觀察到嚴重滑膜細胞增殖、增生的纖維組織和浸潤的炎性細胞。見圖2。

圖2 滑膜細胞增殖(HE×100)

2.3 4組ENO1、CD14和TLR4水平比較 RA組ENO1、CD14和TLR4表達水平較對照組升高(P<0.05),隨RA進展增加,ENO1、CD14和TLR4表達水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 ELISA分析ENO1、CD14和TLR4表達水平n=8,μg/ml,

2.4 4組TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表達水平隨RA進展增加 RA組TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表達水平較對照組升高(P<0.05),隨RA進展增加,TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表達水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 4組TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表達水平比較n=8,

2.5 4組ICAM-1、MCP-1和CCL3蛋白質表達表達水平比較 RA組ICAM-1、MCP-1和CCL3蛋白質表達水平較對照組升高(P<0.05),隨RA進展增加,ICAM-1、MCP-1和CCL3蛋白質表達水平升高(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 蛋白印跡分析ICAM-1、MCP-1和CCL3表達

表4 4組ICAM-1、MCP-1和CCL3表達比較n=8,

2.6 4組單核細胞增殖速率比較 通過ELISA分析單核細胞增殖速率,結果顯示RA組單核細胞增殖速率較對照組升高(P<0.05),隨RA進展增加,單核細胞增殖速率升高(P<0.05)。見表5。

表5 4組細胞增殖速率比較 n=8,

2.7 NF-κB p-p65、p-JNK和MAPK p-p38蛋白質表達表達水平隨RA進展增加 RA組NF-κB p-p65、p-JNK和MAPK p-p38蛋白質表達水平較對照組升高(P<0.05),隨RA進展增加,NF-κB p-p65、p-JNK和MAPK p-p38蛋白質表達水平升高(P<0.05)。見表6。

表6 4組NF-κB p-p65、p-JNK和MAPK p-p38表達水平比較 n=8,

3 討論

RA被認為是一種多因素自身免疫性疾病。其發(fā)病機制涉及表觀遺傳改變、翻譯后修飾、自噬、T細胞和其他因素[18-21]。

眾所周知,炎性反應涉及許多促炎介質,參與了RA發(fā)病機制的每個階段[22-24]。已有研究發(fā)現(xiàn),早期未治療的RA中的自身抗體庫針對幾種抗原,特別是ENO1[25-27]。針對天然ENO1的自身抗體存在于早期RA7患者的血清中,但也存在于多種傳染病和自身免疫性疾病中。雖然自身抗體對瓜氨酸化ENO1的作用在RA中得到了更好的理解,但識別ENO1天然形式的自身抗體的作用仍不清楚。迄今為止,筆者未發(fā)現(xiàn)有研究調查ENO1在免疫系統(tǒng)細胞中的潛在影響。在本研究中,發(fā)現(xiàn)ENO1誘導促炎細胞因子如TNF-α、IL-6和IL-8的早期產生。細胞計數(shù)分析表明ENO1主要與單核細胞結合。此后,單核細胞能夠響應ENO1產生一組促炎細胞因子,如TNF-α、IL-6和IL-8。這些細胞因子在RA病理生理學中具有關鍵作用,包括炎癥的持續(xù)存在。ENO1刺激的單核細胞還產生多種趨化因子,如ICAM-1、MCP-1和CCL3,它們參與急性炎癥狀態(tài)、白細胞的募集和激活。

已有研究表明,ENO1在造血細胞中的上調表面表達在炎癥過程中起重要作用,因為ENO1在人類單核細胞上的細胞表面表達通過ENO1快速轉運到細胞表面而迅速上調[28-30]。ENO1的細胞表面表達增加了從RA患者中分離出的單核細胞和巨噬細胞的數(shù)量,并且針對ENO1的抗體可以刺激這些細胞產生更多的促炎介質,例如TNF-α、IL-1α/β和IFN-γ?？扇苄訡D14由HepG2肝癌細胞和外周血單核細胞在IL-6刺激下產生,這表明可能存在正反饋回路,其中CD14引起RA成纖維細胞樣滑膜細胞炎癥,而IL-6由活化的RA成纖維細胞樣滑膜細胞產生。FLS促進肝細胞和單核細胞進一步產生CD14。分子分析表明,滑膜巨噬細胞中mCD14的蛋白水解切割對CD14的產生很重要。RA的最佳治療仍有許多未滿足的需求。改善疾病的生物抗風濕藥物,如抗TNF-α抗體,在臨床實踐中已顯示出相當大的療效,但許多患者仍存在活動性疾病。TLR4抑制劑治療RA被認為是另一種有希望的候選藥物,一些TLR4抑制劑已在體外和體內顯示出一些治療效果。一種抗TLR4單克隆抗體現(xiàn)已進入II期臨床試驗。進一步了解RA發(fā)病機制中的內源性TLR4配體對于適當和有效地使用這些新治療劑至關重要。在TNF-α抑制劑治療后,RA患者的血清中存在相對較高濃度的CD14(約1 900 ng/ml)。因此,TLR4抑制劑治療可以提供一種新的補充治療,特別是在對TNF-α抑制劑反應不足和SF或血清中高水平CD14的RA患者中。我們發(fā)現(xiàn)ENO1誘導CD14和TLR4的激活。

NF-κB/MAPK通路是RA治療的一個合理的治療靶點。ENO1依賴性激活NF-κB p65、JNK和p38 MAPK磷酸化水平,表明ENO1可能增加血管生成、軟骨退化和骨破壞,因為JNK和p38的激活涉及這些RA相關的病理。

綜上所述,本研究表明,可溶性ENO1通過CD14依賴性TLR4信號通路,誘導促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的早期產生,激活NF-κB/MAPK信號通路,促進單核細胞和滑膜細胞增殖,從而影響RA進展。本研究結果可能為一種涉及阻斷RA中ENO1/CD14/TLR4信號通路的新治療策略指明了方向。