劉金嬋 許德華 李讓 唐田書 陳銘 陳曉琳 饒紹奇

在2020年全球癌癥統(tǒng)計中,肺癌是第二常見,也是死亡率最高的癌癥,對人類健康構(gòu)成了嚴重的威脅。肺癌分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC,15%)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC,85%)[1];NSCLC早期患者以手術(shù)治療為主,Ⅲ期是同步放化療后免疫治療,但患者存活率均較低[2]。因此,找到與NSCLC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子機制,發(fā)現(xiàn)有效的早期診斷生物標(biāo)志物以及臨床治療的潛在靶點,改善患者的生存和預(yù)后,極為重要。circRNA存在共價閉合的單鏈環(huán)構(gòu)象,不易受到破壞,并且存在一個或多個miRNA反應(yīng)元件(miRNA response element,MRE)[3],可基于競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)機制參與癌癥發(fā)展過程中,如circRNAs可作為ceRNA,與miRNA中的MRE結(jié)合,減少miRNA與其靶mRNA結(jié)合,從而調(diào)節(jié)miRNA對靶mRNA的抑制作用。先前研究認為circRNA與各種疾病的發(fā)展過程都具有顯著地相關(guān)性,尤其是關(guān)于癌癥的進展過程[4],同時,circRNA在癌癥細胞和各種體液[5]中特異表達,反映出circRNA作為NSCLC診斷生物標(biāo)志物或治療靶點的極大潛力。在這項研究中,從TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫獲取的芯片數(shù)據(jù),得到NSCLC中差異表達的circRNA、miRNA 和 mRNA并通過這3種RNA來進行ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建并識別出網(wǎng)絡(luò)中的核心circRNA,并從中提取了NSCLC特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò);最后把 ceRNA 機制作為探索非NSCLC發(fā)展過程的出發(fā)點,來進一步說明核心 circRNA在其中是如何通過調(diào)控基因的表達從而作用于癌癥的發(fā)展機制,為開展NSCLC的致病機制、診斷生物標(biāo)志物與治療潛在靶點等研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究使用的3個circRNA芯片數(shù)據(jù)GSE101586 (5病例,5對照),GSE101684 (4病例,4對照) 和 GSE112214 (3病例,3對照)均來源于GEO(gene expression omnibus)數(shù)據(jù)庫。494例NSCLC的miRNA-seq、RNA-seq及臨床信息則來自TCGA(the cancer genome Atlas)數(shù)據(jù)庫。

1.2 差異表達circRNA (DEcircRNA)的篩選 首先,對GEO數(shù)據(jù)庫的circRNA數(shù)據(jù)規(guī)范化和以及對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2的變換,之后采用“l(fā)imma” R軟件包進行差異表達分析,以|log2(Foldchange)| >1和P-value<0.05為標(biāo)準(zhǔn)確定每個數(shù)據(jù)集中差異表達的circRNA (DEcircRNA)。然后,使用“Robust Rank Aggreg”R軟件包的穩(wěn)健的秩集聚法(robust rank aggregation,RRA)根據(jù)表達水平和P-value對3個數(shù)據(jù)集的DEcircRNA進行了整合和排序,確定最優(yōu)的DEcircRNA。

1.3 差異表達mRNA(DEmiRNA)和miRNA(DEm R

NA)的篩選 首先,對TCGA數(shù)據(jù)庫NSCLC的RNA-seq和miRNA-seq數(shù)據(jù)過濾,將表達量較低的基因刪除(過濾標(biāo)準(zhǔn)為:平均表達值<1);隨后,進行差異分析,以FDR校正的P value <0.05和|log2(Foldchange)| >1的標(biāo)準(zhǔn)得到DEmiRNA、DEmRNA的新表達矩陣。

1.4 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心網(wǎng)絡(luò)的提取 首先,從circbase數(shù)據(jù)庫[6]獲取DEcircRNA的fasta序列和從miRbase數(shù)據(jù)庫[7]獲取DEmiRNA的fasta序列。隨后,利用miRanda[8]、 RNAhybrid算法[9]預(yù)測存在結(jié)合靶位的circRNA-miRNA調(diào)控關(guān)系,兩個算法均預(yù)測到的調(diào)控對將納入網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。然后,從miRTarbase數(shù)據(jù)庫[10]中得到DEmiRNA和DEmRNA之間的調(diào)控關(guān)系。根據(jù)對子中相同的 miRNA 進行 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,最終得到了多條完整的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控軸,根據(jù)miRanda算法識別出結(jié)合位點數(shù)>4的circRNA作為核心節(jié)點并提取其調(diào)節(jié)的子網(wǎng)絡(luò)。最后使用 Cytoscape 軟件(版本 3.6.1)可視化。

1.5 功能富集分析和生存分析 首先,利用 “cluster Profile” R包進行GO和KEGG功能通路分析,探討子網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)功能。然后,將從上述的DEmRNA新表達矩陣和臨床信息整合,再使用 “survival” R包對核心子網(wǎng)中的基因進行Kaplan-Meier分析。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達的 RNA circRNA的差異分析結(jié)果顯示,GSE101586、GSE101684、GSE112214芯片分別得到180個、1 341個、587個DEcircRNA。整合3個數(shù)據(jù)集結(jié)果,經(jīng)RRA算法確定了42個DEcircRNA。RNA-seq得到5 537個DEmRNA。miRNA-seq得到362個DEmiRNA。

2.2 構(gòu)建非小細胞肺癌特異性circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)并提取其核心子網(wǎng)絡(luò) 基于miRanda、RNAhybrid算法,本研究得到了642個circRNA-miRNA調(diào)控對子;然后,從miRTarbase數(shù)據(jù)庫獲取了838個miRNA-mRNA調(diào)控對子。借助共享的miRNA,構(gòu)建了包含35個circRNA,77個miRNA,283個mRNA的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。進一步以結(jié)合位點數(shù)>4的8個circRNA為核心,并以其調(diào)控的分子(miRNA和mRNA)為目標(biāo)節(jié)點,提取了1個包含56個節(jié)點(8個circRNA,10個miRNA,38個mRNA)、61條邊的子網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

圖1 NSCLC特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò);菱形、三角形和圓形分別代表DEcircRNA、 DEmiRNA 和 DEmRNA

2.3 非小細胞肺癌特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)的生物

學(xué)意義 對GO的富集分析顯示,該ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)、顯著富集于由中性粒細胞激活參與的免疫反應(yīng)、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、核受體活性,配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性等功能;對KEGG數(shù)據(jù)庫的富集分析顯示,該ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)主要富集于MAPK信號通路、p53信號通路、非小細胞肺癌等通路。以上結(jié)果表明NSCLC特異性ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)涉及多個生物學(xué)過程和信號通路。

2.4 非小細胞肺癌特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)的的臨床意義 生存分析表明NSCLC特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)中有14個基因顯著影響患者的預(yù)后情況(P<0.05)。與低表達組比較,ANGPTL4、FOXM1、HMGA2、HOXA1,OPRM1,PMAIP1,LDHA,TWIST1,MTFR1,PLK1基因高表達組的預(yù)后較差;而MAP3K8、TGFBR2、BTK、CX3CR1基因高表達組的預(yù)后較好(或解釋為保護因子)。見圖2。

圖2 NSCLC特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)中14個預(yù)后基因標(biāo)記的生存曲線

3 討論

circRNA作為一種新的診斷標(biāo)志物和治療分子,已被研究并應(yīng)用于多種疾病的診斷和治療中。目前多個研究均基于單個cirRNA,而復(fù)雜疾病的發(fā)展是由于多個生物分子相互作用的復(fù)合物的擾動引起的[11]。此外,在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中,一個circRNA競爭性吸附多個miRNA,一個miRNA也可被多個circRNA吸附,導(dǎo)致下游基因的表達異常?；谝陨鲜聦?本研究希望通過構(gòu)建包含circRNA、miRNA和mRNA的完整ceRNA網(wǎng)絡(luò),系統(tǒng)地闡明NSCLC的病理機制并識別與其預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記。然而在NSCLC的以往研究中,較少有針對circRNA介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的全基因組研究。本研究通過充分結(jié)合兩個數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建了由circRNA介導(dǎo)的NSCLC特異性ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從中提取出連通度較高的節(jié)點以及由節(jié)點所介導(dǎo)的核心子網(wǎng)絡(luò)。最后,通過富集分析和生存分析,闡明了NSCLC特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)意義和臨床意義。

ceRNAs和miRNAs共享MRE的數(shù)量被證明是ceRNA交叉調(diào)節(jié)的關(guān)鍵決定因素[12],具有異常高密度結(jié)合位點的circRNA可能會在疾病網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究利用miRanda算法挖掘到8個核心的circRNA,其中hsa_circ_0001666/0008234/0001947均已被發(fā)現(xiàn)與肺癌相關(guān)。hsa_circ_0001666高表達與NSCLC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期呈正相關(guān)[13]。而hsa_circ_0001947則在NSCLC組織和細胞中低表達,敲低后增強了細胞活力和增殖能力,誘導(dǎo)細胞生長時停留在S期,最終導(dǎo)致增殖異常[14]。

8個核心circRNA調(diào)控的10個miRNA中,hsa-miR-671-5p、hsa-miR-503-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-296-3p、has-miR-197已被報道與NSCLC密切相關(guān),如miR-671-3p在NSCLC組織和細胞系中表達上調(diào)[15],通過調(diào)節(jié)FOXP2促進癌細胞增殖、凋亡和遷移。hsa-miR-503-3p在NSCLC中表達上調(diào),并發(fā)現(xiàn)其在癌癥原發(fā)性耐藥中發(fā)揮重要作用[16]。其余5個miRNA雖暫時未見有報道與NSCLC相關(guān),但均被發(fā)現(xiàn)與一種或多種癌癥相關(guān)。上述說明本文識別的與circRNA有調(diào)控關(guān)系的10個miRNA在NSCLC或其他癌癥中發(fā)揮重要作用,其生物學(xué)意義是明確。

本研究通過對特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)進行功能通路富集分析發(fā)現(xiàn),子網(wǎng)絡(luò)主要參與到中性粒細胞激活參與免疫反應(yīng)、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、MAPK信號通路、p53信號通路、非小細胞肺癌等。中性粒細胞是免疫細胞家族的關(guān)鍵成員,激活后表達大量膜受體,識別和消除感染因子[17]。KEGG富集結(jié)果中的大部分通路已有文獻報道與NSCLC發(fā)生機制密切相關(guān),如經(jīng)典的p53信號通路[18]作為一條抑癌通路廣泛參與到NSCLC中。另外,子網(wǎng)還直接富集到NSCLC的通路上。以上信息提示,本研究所篩選的核心cirRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)密切涉及了NSCLC整個發(fā)展過程。

生存分析表明NSCLC特異性核心子網(wǎng)絡(luò)中有14個基因顯著影響患者的預(yù)后情況,而網(wǎng)絡(luò)中的8個核心circRNA很可能通過ceRNA調(diào)控網(wǎng)來調(diào)節(jié)這些基因,影響其表達,對患者預(yù)后產(chǎn)生作用。例如:在hsa_circ_0001320/0001947/0008234-hsa-miR-370-3p-MAP3K8/TGFBR2調(diào)控軸中,cirRNA下調(diào)、miRNA上調(diào)、mRNA下調(diào),3個circRNA的低表達會減少與miR-370-3p的結(jié)合,使更多的miR-370-3p與MAP3K8、TGFBR2直接結(jié)合,導(dǎo)致MAP3K8、TGFBR2在體內(nèi)的含量降低。TGFBR2的缺失會增加腫瘤侵襲性并降低肺腺癌的存活率[19]。

而本文生存分析的結(jié)果以及相關(guān)研究[20]都表明,MAP3K8、TGFBR2基因表達量低的患者,生存率相對較低。因此,推測hsa_circ_0001320/0001947/0008234等circRNA的低表達可能與NSCLC患者的不良預(yù)后相關(guān)。在hsa_circ_0049271-hsa-miR-210-3p-BTK這一條調(diào)控關(guān)系上,circ_0049271表達下調(diào)、miR-197-3p、BTK表達上調(diào),說明circ_0049271下調(diào)可導(dǎo)致BTK的低表達,BTK調(diào)節(jié)p53的活性以增強細胞凋亡、衰老反應(yīng)以及腫瘤抑制反應(yīng)[21]。生存分析同時也顯示BTK低表達組患者預(yù)后較差,提示hsa_circ_0049271低表達與NSCLC患者不良預(yù)后相關(guān)?？傊?本文通過構(gòu)建NSCLC特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)識別出來的8個circRNA可能通過與一個或多個miRNA結(jié)合,以此來調(diào)節(jié)與預(yù)后顯著相關(guān)基因的表達,進而影響NSCLC患者總體預(yù)后情況。

然而,我們也注意到本研究的不足之處。(1)用于篩選差異表達circRNA的三套數(shù)據(jù)樣本量偏小,可能會缺少足夠的統(tǒng)計功效識別微小或中度效應(yīng)的circRNA。(2)部分circRNA、miRNA和mRNA之間的調(diào)控關(guān)系是通過計算機算法識別的,缺少實驗室的證據(jù)。(3)研究所選的數(shù)據(jù)針對西方群體,因此本次研究是否能推廣和應(yīng)用到中國人群中,仍然需要進行探討。本研究通過整合多組學(xué)的數(shù)據(jù),系統(tǒng)性分析了circRNA、miRNA和mRNA之間的調(diào)控關(guān)系,并構(gòu)建NSCLC特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)。進一步功能富集分析和生存分析表明NSCLC特異性ceRNA核心子網(wǎng)絡(luò)具備清晰的生物學(xué)意義和臨床意義,在8個circRNA介導(dǎo)的基因中,有14個基因顯著影響患者的預(yù)后情況。