高偉 李慧穎 李丹

缺血性心臟病是常見的心血管疾病,它可導致心肌缺血缺氧,最終導致心肌細胞死亡[1]。心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是缺血性心臟病的常見臨床和病理狀態(tài),尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)后。心肌I/R損傷是AMI治療失敗和病情惡化的主要原因之一[2]。普拉克索是一種選擇性多巴胺D2受體激動劑,具有多巴胺能活性、抗氧化活性和神經保護作用[3]。先前的研究表明,普拉克索對心肌I/R損傷具有保護作用,其通過促進心肌細胞自噬和活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生,改善缺氧/復氧心肌細胞存活率,降低乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性[4],然而,作用機制尚未完全明確。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是一種促氧化蛋白,對硫氧還蛋白的活性及其抗氧化功能具有負性調節(jié)作用[5]。已有研究表明,心臟特異性TXNIP過表達通過誘導ROS產生和心肌細胞凋亡,促進心肌I/R損傷小鼠心功能不全,而心臟特異性TXNIP基因敲除則會減輕I/R誘導的心肌細胞損傷,改善心功能[6]。另有研究表明,敲低TXNIP通過抑制p38和C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinse,JNK)磷酸化減輕氧糖剝奪所致的神經元細胞氧化應激損傷,從而在缺血性卒中中發(fā)揮保護作用[7]。本研究旨在探究普拉克索對氧糖剝奪/再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)心肌細胞的作用及機制是否與TXNIP和p38/JNK通路相關,以期為明確普拉克索在心肌I/R損傷中的藥理作用機制及開發(fā)新的心肌I/R損傷治療藥物提供新的科學資料。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞H9c2購自中國科學院細胞庫;普拉克索購自美國MedChemExpress;Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國ThermoFisher Scientific;TXNIP 過表達載體(oe-TXNIP)及其陰性對照(oe-NC)購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司;CCK-8試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(比色法)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)測定試劑盒(免疫抑制法)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)和總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1 法)購自南京建成生物工程研究所;Reactive Oxygen Species Assay Kit 活性氧(ROS)檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司;TXNIP和GAPDH抗體購自英國Abcam公司;p-p38、p38、p-JNK和JNK抗體購自美國Cell Signaling Technology;AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及OGD/R處理 H9c2細胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),條件為37℃、5%CO2和95%空氣。待細胞密度達到80%～90%時,胰酶液消化細胞,按照需求進行傳代培養(yǎng)或者是鋪板操作。參考文獻[8],對H9c2細胞進行OGD/R處理。首先將H9c2細胞培養(yǎng)基更換為無糖DMEM培養(yǎng)基,隨后將細胞置于37℃、94% N2、5% CO2、1%O2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)6 h。將細胞培養(yǎng)基更換為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,正常培養(yǎng)6 h。收集細胞,進行后續(xù)實驗操作。

1.3 普拉克索使用濃度檢測 將對數(shù)期生長的H9c2細胞接種于96孔板,每孔1×104個細胞。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將細胞隨機分為0 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組、80 μmol/L組、100 μmol/L組、120 μmol/L組和140 μmol/L組,按照分組,向細胞中添加不同濃度普拉克索。另設空白組(無細胞和試劑)用以讀值調零。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,按照CCK-8試劑盒說明書所示檢測各組細胞光密度(OD)值。細胞活力(%)=(給藥組OD值-空白組OD值)/(0 μmol/L組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 細胞分組及給藥處理 取對數(shù)期生長的H9c2細胞接種于6孔板,每孔1×106個細胞。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將細胞隨機分為對照組、OGD/R組、Pra-50 μmol/L組(添加普拉克索50 μmol/L)和Pra-100 μmol/L組(添加普拉克索100 μmol/L),按照分組,添加普拉克索,而對照組和OGD/R組添加等量溶劑。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,除對照組外,其余組均進行OGD/R處理。收集細胞,進行后續(xù)實驗操作。

1.5 細胞轉染 取對數(shù)期生長的H9c2細胞接種于6孔板,1×106個/孔。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將細胞隨機分為OGD/R組(不進行轉染操作)、Pra-100 μmol/L組(添加100 μmol/L普拉克索但不進行轉染操作)、Pra-100 μmol/L+oe-NC組(添加100 μmol/L 普拉克索并轉染oe-NC)和Pra-100 μmol/L+oe-TXNIP組(添加100 μmol/L普拉克索并轉染oe-TXNIP)。按照分組,根據(jù)Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行細胞轉染,細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。添加普拉克索處理細胞24 h后,對各組細胞進行OGD/R處理。收集細胞,進行后續(xù)實驗操作。

1.6 CCK-8檢測細胞活力 取對數(shù)期生長的H9c2細胞接種于96孔板,每孔1×104個細胞。按照1.4和1.5所示對細胞進行分組和處理。此外,另設空白組(無細胞和試劑)用以讀值調零。根據(jù)CCK-8試劑盒說明書所示檢測各組細胞光密度(OD)值。細胞活力(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%或者是細胞活力(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(OGD/R組OD值-空白組OD值)×100%。

1.7 試劑盒檢測LDH和CK-MB活性、MDA和SOD含量 收集H9c2細胞及其培養(yǎng)上清液,按照試劑盒說明書所示檢測細胞或培養(yǎng)上清液中LDH和CK-MB活性、MDA和SOD含量。

1.8 流式細胞術檢測ROS產生 棄去H9c2細胞培養(yǎng)上清液,PBS清洗后,向細胞中加入濃度為10 μmol/L的DCFH-DA工作液,37℃培養(yǎng)箱內避光孵育30 min后,用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗細胞后,收集細胞,上流式細胞儀檢測ROS產生。

1.9 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集H9c2細胞,預冷PBS洗滌細胞后重新收集細胞。向細胞中加入1×結合緩沖液將細胞密度調整為1×106個/ml。取100 μl 細胞懸液,向細胞中添加5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI 染色液,輕輕混勻,室溫條件下避光孵育15 min。加入400 μl 1×結合緩沖液,充分混勻后,立即用流式細胞儀檢測。

1.10 Western blot檢測TXNIP、p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白表達 收集H9c2細胞,裂解液裂解細胞。收集上清液并測定其蛋白濃度。各組取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳以及轉膜操作。5%脫脂奶粉室溫條件下封閉3 h,加入TXNIP(1∶1 000)、p-p38(1∶2 000)、p38(1∶1 000)、p-JNK(1∶2 000)、JNK(1∶2 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體,4℃條件下孵育過夜。加入二抗(1∶5 000),室溫條件下孵育1 h。凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶,Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.11 qRT-PCR檢測TXNIP mRNA表達 收集H9c2細胞,Trizol試劑提取細胞總RNA。將RNA反轉錄為cDNA,并按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明書所示,進行后續(xù)實驗。反應程序:95℃、5 min;95℃、10 s,60℃、30 s,40個循環(huán);95℃、15 s,60℃、60 s,95℃、15 s。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt法計算TXNIP mRNA表達。TXNIP上游引物:5’-AAGCGT

TGAGTAGTACAGATGAG-3’; TXNIP下游引物:5’-GGTATGGCGTGGCAAGAGTC-3’;GAPDH上游引物:5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3’; GAPDH下游引物:5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’。

2 結果

2.1 普拉克索對OGD/R心肌細胞活力、氧化應激和凋亡的影響

2.1.1 與0 μmol/L組比較,120 μmol/L組和140 μmol/L組心肌細胞活力降低(P<0.05),而20 μmol/L組、40 μmol/L組、80 μmol/L組和100 μmol/L組心肌細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),因此,后續(xù)實驗中普拉克索的最大安全濃度為100 μmol/L。見表1。

表1 CCK-8檢測不同濃度普拉克索處理下的細胞活力 %,

2.1.2 與對照組比較,OGD/R組心肌細胞活力降低,心肌細胞ROS產生和細胞凋亡率升高(P<0.05);與OGD/R組相比,Pra-50 μmol/L組和Pra-100 μmol/L組心肌細胞活力升高,心肌細胞ROS產生和細胞凋亡率降低(P<0.05),且普拉克索的作用呈劑量依賴性。見表2,圖1。

圖1 流式細胞術檢測細胞ROS產生和心肌細胞凋亡;A 流式細胞術檢測細胞ROS產生;B流式細胞術檢測普拉克索對OGD/R心肌細胞凋亡的影響

表2 普拉克索對OGD/R心肌細胞損傷的影響 %,

2.2 普拉克索對OGD/R心肌細胞TXNIP表達和p38/JNK通路的影響 與對照組相比,OGD/R組心肌細胞TXNIP、p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表達升高(P<0.05);與OGD/R組相比,Pra-50 μmol/L組和Pra-100 μmol/L組心肌細胞TXNIP、p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表達降低(P<0.05),且普拉克索的作用呈劑量依賴性。見表3,圖2。

圖2 Western blot檢測普拉克索對OGD/R心肌細胞TXNIP表達和p38/JNK通路的影響

表3 Western blot檢測普拉克索對OGD/R心肌細胞TXNIP表達和p38/JNK通路的影響

2.3 過表達TXNIP逆轉普拉克索對OGD/R心肌細胞活力、氧化應激和凋亡的影響 與OGD/R組相比,Pra-100 μmol/L組心肌細胞中TXNIP mRNA和蛋白表達降低(P<0.05),細胞活力升高,心肌細胞ROS產生和細胞凋亡率降低(P<0.05);與Pra-100 μmol/L組相比,Pra-100 μmol/L+oe-NC組心肌細胞中TXNIP mRNA和蛋白表達、細胞活力、心肌細胞ROS產生和細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與Pra-100 μmol/L+oe-NC組相比,Pra-100 μmol/L+oe-TXNIP組心肌細胞中TXNIP mRNA和蛋白表達升高(P<0.05),細胞活力降低,心肌細胞ROS產生和細胞凋亡率升高(P<0.05)。見表4、5,圖3、4。

圖3 過表達TXNIP逆轉普拉克索對OGD/R心肌細胞氧化應激和凋亡的影響;A 流式細胞術檢測細胞ROS產生;B 流式細胞術檢測普拉克索對OGD/R心肌細胞凋亡的影響

圖4 Western blot檢測細胞中TXNIP蛋白表達

表4 Western blot檢測普拉克索對OGD/R心肌細胞TXNIP表達和p38/JNK通路的影響

表5 過表達TXNIP逆轉普拉克索對OGD/R心肌細胞損傷的影響

2.4 過表達TXNIP逆轉普拉克索對OGD/R心肌細胞p38/JNK通路的影響 與OGD/R組相比,Pra-100 μmol/L組心肌細胞中p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表達降低(P<0.05);與Pra-100 μmol/L組相比,Pra-100 μmol/L+oe-NC組心肌細胞中p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與Pra-100 μmol/L+oe-NC組相比,Pra-100 μmol/L+oe-TXNIP組心肌細胞中p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表達升高(P<0.05)。見圖5,表6。

圖5 Western blot檢測過表達TXNIP逆轉普拉克索對OGD/R心肌細胞p38/JNK通路的影響

表6 Western blot檢測過表達TXNIP逆轉普拉克索對OGD/R心肌細胞p38/JNK通路的影響

3 討論

PCI術后缺血心肌組織恢復了血流供應,挽救了瀕臨死亡的心肌細胞,大大降低了心肌梗死患者的致殘率和死亡率[9]。然而,PCI治療并不能減輕或恢復心肌細胞的缺血性損傷,反而加重了部分AMI患者的心肌損傷程度[10]。如何預防和減輕AMI的I/R損傷已成為亟待解決的問題。

LDH和CK-MB在心肌細胞中有組成性表達,在正常生理狀態(tài)下不能穿透細胞膜;但當細胞受損或死亡時,它們會被釋放出來[11]。因此,培養(yǎng)液中LDH和CK-MB的活性代表了OGD/R對H9c2細胞損傷的程度。已有研究表明,普拉克索在嗎啡誘導的小鼠不良心室重構中發(fā)揮保護作用[12]。此外,普拉克索對心肌I/R損傷也具有保護作用[4]。結果表明,普拉克索可抑制OGD/R誘導的心肌細胞損傷。心肌I/R損傷包括一系列復雜的病理過程,包括炎性反應、鈣超載、補體激活、細胞自噬和凋亡[13]。研究證實,氧化應激和細胞凋亡在這一病理過程中起著重要作用。抑制I/R損傷后的氧化應激水平和心肌細胞凋亡將是防治AMI I/R所致心肌損傷的重要手段[14]。目前的證據(jù)顯示,普拉克索通過其抗凋亡和抗氧化作用在創(chuàng)傷性腦損傷大鼠中發(fā)揮神經保護作用[15]。本研究結果顯示,普拉克索可抑制OGD/R誘導的心肌細胞氧化應激和細胞凋亡。

TXNIP作為細胞氧化還原平衡的關鍵因子,是氧化應激與炎癥損傷之間重要的橋梁[16]。TXNIP是組織I/R損傷過程的重要參與者。靶向TXNIP是保護大腦免受缺血性腦損傷的潛在治療策略[17];TXNIP還參與腸I/R損傷過程,二甲雙胍通過抑制TXNIP表達降低氧化應激和炎性反應,從而改善小鼠腸I/R損傷[18];此外,TXNIP還參與心肌I/R損傷過程。刺芒柄花素通過抑制TXNIP介導的通路,減輕心功能不全、梗死面積、心臟標志物釋放、ROS產生和炎性反應,從而改善大鼠心肌I/R損傷[19]。本研究結果顯示,普拉克索通過抑制TXNIP表達在OGD/R誘導的心肌細胞損傷中發(fā)揮保護作用。

研究表明,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號的持續(xù)激活在調節(jié)細胞增殖、促凋亡蛋白表達和ROS產生中起著至關重要的作用[20]。p38和JNK是MAPK家族的成員[20],參與脊髓I/R損傷過程,抑制p38/JNK通路可減輕大鼠脊髓I/R損傷[21]。另有證據(jù)顯示,OGD/R處理可誘導神經元細胞中p38/JNK通路的激活,靶向抑制p38/JNK通路促進細胞存活并抑制細胞凋亡,從而抑制神經元細胞OGD/R損傷[22]。此外,p38/JNK通路還參與心肌I/R損傷過程。抑制p38/JNK通路可抑制氧化應激和細胞凋亡,從而改善H9c2細胞I/R損傷[23]。目前,已有證據(jù)顯示,TXNIP可介導p38/JNK通路的活化。TXNIP通過激活p38/JNK通路促進細胞凋亡和氧化應激,從而促進OGD/R誘導的肝細胞損傷[24]。本研究結果顯示,普拉克索通過抑制TXNIP表達抑制OGD/R誘導的心肌細胞中p38/JNK通路激活。

綜上所述,本研究結果表明,普拉克索可能通過下調TXNIP表達抑制OGD/R誘導的心肌細胞中p38/JNK通路激活,從而抑制細胞氧化應激和凋亡,在OGD/R誘導的心肌細胞損傷中發(fā)揮保護作用。該研究結果為明確普拉克索在心肌I/R損傷中的作用及開發(fā)新的治療藥物提供了新的科學資料。