楊依綃，肖艷群，黃中強(qiáng)，鮑 蕓（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126）

B 族鏈球菌（group BStreptococcus，GBS）是革蘭氏陽(yáng)性菌，常定植于人體下消化道及泌尿道中，屬于條件致病菌[1]。臨床研究表明，GBS 是引起圍產(chǎn)期生殖道感染的首要致病菌[2]。GBS 可通過(guò)羊水由母體傳播給新生兒，從而導(dǎo)致胎兒窘迫并增加新生兒感染風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。目前臨床廣泛開(kāi)展了對(duì)妊娠中晚期孕婦GBS 篩查檢測(cè)，多項(xiàng)專家共識(shí)建議微生物培養(yǎng)法結(jié)合核酸擴(kuò)增檢測(cè)以提高圍產(chǎn)期母嬰感染GBS 的檢出率[5-8]。熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(polymerase chain reaction，PCR)已成為臨床常用的檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的微生物鑒定方法相比，熒光PCR 法不需要進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，能在2～3h 內(nèi)快速進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的敏感度和特異度[9]。但熒光PCR 檢測(cè)中涉及到對(duì)目的片段的體外特異性PCR擴(kuò)增，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[10]，影響后續(xù)臨床干預(yù)措施。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量尤為重要，本研究在全國(guó)首次開(kāi)展GBS 核酸檢測(cè)項(xiàng)目的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（簡(jiǎn)稱室間質(zhì)評(píng)），對(duì)該項(xiàng)目的檢測(cè)質(zhì)量進(jìn)行調(diào)查評(píng)估，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)室上報(bào)結(jié)果總結(jié)，分析臨床實(shí)驗(yàn)室存在的問(wèn)題，加強(qiáng)臨床實(shí)驗(yàn)室該項(xiàng)目檢測(cè)的質(zhì)量控制意識(shí)，提高檢測(cè)質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 參評(píng)實(shí)驗(yàn)室 2021年參加GBS 核酸檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃參評(píng)實(shí)驗(yàn)室為33 家，參評(píng)實(shí)驗(yàn)室主要來(lái)自三級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)、二級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)和第三方實(shí)驗(yàn)室。兩次質(zhì)評(píng)活動(dòng)開(kāi)展時(shí)間分別為：2021年5月12日～5月18日和2021年9月7日～9月14日。

1.2 質(zhì)控物 室間質(zhì)評(píng)樣本盤準(zhǔn)備室間質(zhì)評(píng)樣本購(gòu)自上海之江生物有限公司，由滅活的GBS 培養(yǎng)液經(jīng)稀釋液稀釋而成。樣本盤包含5 份樣本，4 支不同濃度陽(yáng)性樣本和1 支陰性樣本，每支500μl，于-20℃保存。

1.3 方法

1.3.1 室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃實(shí)施：GBS 核酸檢測(cè)項(xiàng)目室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃為一年兩次，兩次室間質(zhì)評(píng)樣本盤分別含有5 份樣本，其中陰性樣本1 支及4 種不同濃度陽(yáng)性樣本各1 支。5 支樣本隨機(jī)編碼后冷鏈發(fā)送至各參評(píng)實(shí)驗(yàn)室。要求參評(píng)實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定時(shí)間內(nèi)按照常規(guī)樣本檢測(cè)流程進(jìn)行檢測(cè)并將結(jié)果通過(guò)網(wǎng)絡(luò)上報(bào)至中心數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.2 室間質(zhì)評(píng)樣本的評(píng)價(jià)

1.3.2.1 均一性評(píng)價(jià)：參照中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)CNAS-GL003：2018《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》要求，室間質(zhì)量評(píng)價(jià)調(diào)查前從制備好的能力驗(yàn)證樣本中選取1 個(gè)批號(hào)弱陽(yáng)性樣本和陰性樣本隨機(jī)抽取10 個(gè)樣本，使用GBS DNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，具體操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)二次。

1.3.2.2 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)：在每次室間質(zhì)評(píng)結(jié)果上報(bào)截止日前后3日內(nèi)，進(jìn)行同步穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。選取1 個(gè)批號(hào)陽(yáng)性和陰性樣本，數(shù)量為各6 支，使用GBS DNA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，每個(gè)樣本檢測(cè)一次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 室間結(jié)果分析：根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室回報(bào)結(jié)果計(jì)算各參評(píng)實(shí)驗(yàn)室的得分情況。室間質(zhì)評(píng)成績(jī)計(jì)算為檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期相符的百分率。≥80%判定為室間質(zhì)評(píng)成績(jī)合格。同時(shí)計(jì)算每個(gè)樣本的總體符合率、假陽(yáng)性率和假陰性率，并與實(shí)驗(yàn)室溝通分析錯(cuò)誤檢測(cè)結(jié)果的原因。

2 結(jié)果

2.1 室間質(zhì)評(píng)樣本驗(yàn)證結(jié)果 2021年室間質(zhì)評(píng)樣本采用熒光PCR 法確定各樣本的靶值，GBS 核酸檢測(cè)為定性結(jié)果，各樣本檢測(cè)原始擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖1。二次室間質(zhì)評(píng)樣本盤構(gòu)成及預(yù)期結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 2021年室間質(zhì)評(píng)樣本盤構(gòu)成及檢測(cè)符合率

圖1 二次室間質(zhì)評(píng)樣本熒光PCR 檢測(cè)擴(kuò)增曲線圖

采用熒光PCR 法進(jìn)行均一性和穩(wěn)定性檢測(cè)，所有樣本檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，符合率為100%，表明室間質(zhì)評(píng)樣本具有良好的均一性和同步穩(wěn)定性。

2.2 參評(píng)實(shí)驗(yàn)室總體情況 2021年GBS 核酸檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃參評(píng)實(shí)驗(yàn)室為33 家，兩次質(zhì)評(píng)活動(dòng)中收到的有效回報(bào)結(jié)果分別為31 份（其中上海地區(qū)19 家，其它地區(qū)12 家）和32 份（其中上海地區(qū)19 家，其它地區(qū)13 家），結(jié)果有效回報(bào)率為96.88%（31/32）和96.97%（32/33）。室間質(zhì)評(píng)樣本檢測(cè)符合率見(jiàn)表1。此外，本文還對(duì)參加二次室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃的實(shí)驗(yàn)室類別進(jìn)行了分析，參評(píng)實(shí)驗(yàn)室來(lái)自各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)，其中來(lái)自三級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)各有18 家，二級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)各3 家，第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室各10 家和11 家。三級(jí)、二級(jí)和第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室在2 次室間質(zhì)評(píng)中占比分別為58%，32%，10%和56%，34%，10%。

2.3 室間質(zhì)評(píng)結(jié)果評(píng)價(jià)分析 GBS 核酸為定性檢測(cè)項(xiàng)目，根據(jù)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室上報(bào)的定性結(jié)果統(tǒng)計(jì)得分。2021年兩次室間質(zhì)評(píng)中，結(jié)果回報(bào)完全正確的實(shí)驗(yàn)室分別為87.10%（27/31）和96.88%（31/32），樣本檢測(cè)的總體符合率分別為97.42%（151/155）和99.38%(159/160)?；貓?bào)錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)室第1 次室間質(zhì)評(píng)中有4 家，第2 次室間質(zhì)評(píng)中有1 家。2 次室間質(zhì)評(píng)中對(duì)實(shí)驗(yàn)室采用的7 種不同檢測(cè)試劑的檢測(cè)效能進(jìn)行了比較研究，7 種試劑對(duì)室間質(zhì)評(píng)樣本都能正常檢測(cè)，見(jiàn)表2。

表2 參評(píng)實(shí)驗(yàn)室所用檢測(cè)試劑和檢測(cè)能力

二次室間質(zhì)評(píng)中陰性樣本的檢測(cè)符合率為100%（63/63），陽(yáng)性樣本的檢測(cè)符合率為98.02%（247/252）。結(jié)果匯總中共出現(xiàn)5 例錯(cuò)誤，集中表現(xiàn)為假陰性。其中4個(gè)濃度陽(yáng)性樣本（濃度從低到高）檢測(cè)符合率分別為93.65%（59/63），100%（63/63），98.41%（62/63）和100%（63/63）。實(shí)驗(yàn)室上報(bào)的錯(cuò)誤結(jié)果主要出現(xiàn)在弱陽(yáng)性樣本（2115 號(hào)和2121號(hào)樣本）檢測(cè)結(jié)果。第一次室間質(zhì)評(píng)結(jié)果上報(bào)錯(cuò)誤的4 家實(shí)驗(yàn)室，其中3 家在第二次室間質(zhì)評(píng)中檢測(cè)符合率提高至100%。

3 討論

GBS 核酸檢測(cè)能夠幫助臨床快速識(shí)別妊娠期女性病原體感染的發(fā)生，為使用抗生素進(jìn)行產(chǎn)前預(yù)防性干預(yù)治療，降低圍生期感染性疾病的發(fā)生率提供依據(jù)[11]。本研究在國(guó)內(nèi)首次開(kāi)展了GBS 核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃，對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量進(jìn)行了有效評(píng)估。

分析室間質(zhì)評(píng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，檢測(cè)錯(cuò)誤主要是部分實(shí)驗(yàn)室弱陽(yáng)性樣本未檢出。分析錯(cuò)誤產(chǎn)生的原因可能有以下幾點(diǎn)：①GBS 為革蘭氏陽(yáng)性菌，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較革蘭氏陰性菌更致密復(fù)雜，需要經(jīng)過(guò)高溫加熱裂解破壁才能釋放核酸，提取過(guò)程中存在金屬浴/水浴溫度實(shí)際溫度低于正常，樣本加熱時(shí)間不足等情況可能導(dǎo)致細(xì)胞壁裂解不充分，核酸提取效率下降；②檢測(cè)試劑在運(yùn)輸、儲(chǔ)存過(guò)程中保存不當(dāng)，DNA 聚合酶部分失活或熒光探針部分降解，試劑檢測(cè)效能下降；③實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員存在試劑配制或加樣量不準(zhǔn)確等操作誤差。建議實(shí)驗(yàn)室從以下方面改進(jìn)：①嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書要求進(jìn)行操作，確保樣本的充分裂解；②定期進(jìn)行儀器設(shè)備（如金屬浴、移液器、溫度計(jì)等）的校準(zhǔn)，確保所有實(shí)驗(yàn)條件滿足要求；③按要求在使用新批次試劑前進(jìn)行批間差質(zhì)檢，確保新批次試劑的檢測(cè)效能，同時(shí)嚴(yán)格按說(shuō)明書要求儲(chǔ)存試劑，并定期監(jiān)控儲(chǔ)存溫度；④加強(qiáng)人員培訓(xùn)，尤其是新進(jìn)技術(shù)人員的實(shí)驗(yàn)操作培訓(xùn)，定期考核并開(kāi)展人員比對(duì)，提高檢測(cè)能力。

值得一提的是三家在第一次室間質(zhì)評(píng)中出現(xiàn)錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)室在第二次室間質(zhì)評(píng)中結(jié)果全部正確，質(zhì)評(píng)成績(jī)均為滿分。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室通過(guò)參加室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃，能夠有效發(fā)現(xiàn)日常檢測(cè)中的問(wèn)題，在及時(shí)進(jìn)行原因分析并采取有效的糾正措施進(jìn)行內(nèi)部整改后，能夠改進(jìn)質(zhì)量提高檢測(cè)水平。

本研究利用滅活的GBS 培養(yǎng)液經(jīng)稀釋作為質(zhì)控品，能夠有效監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室從核酸提取到PCR 結(jié)果分析的檢測(cè)全過(guò)程。參評(píng)實(shí)驗(yàn)室使用多種不同檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)且結(jié)果正常，表明其具有良好的臨床適用性。但與臨床樣本相比，本研究中使用的質(zhì)控品只包含GBS 一種微生物，所含的微生物種類單一，不能完全模擬某些復(fù)雜臨床樣本，已有的研究表明不同檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)臨床樣本的檢測(cè)特異度和抗干擾能力存在差異[12]。今后的研究中，可以考慮使用含有多種生殖道微生物種群的復(fù)合樣本，以考察不同檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)特異度和抗干擾能力。

隨著分子診斷技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室的不斷推廣，GBS 核酸檢測(cè)已逐漸取代傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法成為臨床常用的檢測(cè)方法，其檢測(cè)質(zhì)量對(duì)于結(jié)果的準(zhǔn)確度十分重要，希望通過(guò)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃的開(kāi)展，幫助實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)整改，保證質(zhì)量，為后續(xù)臨床干預(yù)提供有力的技術(shù)支撐。