孫 飛，黎春明（海口市第三人民醫(yī)院泌尿外科，海口 571100）

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全球男性中最常見(jiàn)的侵襲性惡性腫瘤之一，也是第二大致死性異質(zhì)性癌癥[1]。在我國(guó)，隨著人口老齡化和診斷技術(shù)的提高，近年來(lái)前列腺癌的發(fā)病率明顯上升，并逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。前列腺癌的病因尚不明確，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制是一個(gè)涉及多種因素的復(fù)雜過(guò)程，包括吸煙、肥胖、種族、食物、年齡、化學(xué)和輻射暴露、性傳播疾病等[2]。目前，前列腺癌的治療包括手術(shù)切除、放化療、內(nèi)分泌治療和免疫治療，根治性前列腺切除術(shù)被認(rèn)為是局限性前列腺癌的主要治療方法[3]。然而，大約20%的前列腺癌患者會(huì)發(fā)生生化復(fù)發(fā)，前列腺特異性抗體的血清水平迅速升高，最終發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌[4]，這也是前列腺癌腫瘤特異性死亡的主要原因。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明免疫系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，如免疫微環(huán)境和免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞)。腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞(tumor infiltrating immune cells,TIICs)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，可以改變腫瘤的免疫狀態(tài)[5]。一些研究已經(jīng)通過(guò)靶向TIICs 證明了針對(duì)腫瘤的治療策略，其中涉及前列腺癌和TIICs 的臨床結(jié)果和潛在機(jī)制也已被廣泛報(bào)道[6]，但通過(guò)分析免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的免疫評(píng)分模型對(duì)前列腺癌患者免疫治療效果及預(yù)后的預(yù)測(cè)研究較少。因此，本文基于免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的免疫評(píng)分模型，對(duì)前列腺癌免疫治療的效果和預(yù)后展開(kāi)分析。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 從癌癥基因組圖譜 (the cancer genome atlas,TCGA) 選取266 個(gè)前列腺癌患者的基因表達(dá)譜和臨床隨訪參數(shù)，并對(duì)整個(gè)相關(guān)候選數(shù)據(jù)集進(jìn)行識(shí)別和評(píng)估?；颊吣挲g51～79(65.23 ± 6.98）歲。

數(shù)據(jù)集的納入標(biāo)準(zhǔn)：①癌癥手術(shù)切緣陰性的樣本；②每個(gè)數(shù)據(jù)集包含的標(biāo)本超過(guò)60 個(gè)；③包括臨床病理特征（臨床分期、前列腺特異性抗原和結(jié)果）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①數(shù)據(jù)庫(kù)缺乏有效和足夠的樣本數(shù)據(jù)；②先前合格數(shù)據(jù)庫(kù)的副本；③除手術(shù)切除外還進(jìn)行放療或化療的患者。

1.2 方法

1.2.1 篩選腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞：利用TCGA 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過(guò)單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA）量化免疫細(xì)胞并得到相關(guān)免疫細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)情況。ssGSEA 根據(jù)基因在樣本中的絕對(duì)表達(dá)對(duì)基因進(jìn)行排序，并通過(guò)整合基因排序的經(jīng)驗(yàn)累積分布函數(shù)之間的差異來(lái)計(jì)算富集分?jǐn)?shù)[7-8]。進(jìn)而表示特定基因集中的基因在單個(gè)樣本中協(xié)調(diào)上調(diào)或下調(diào)的程度。

1.2.2 通過(guò) LASSO 分析篩選關(guān)鍵預(yù)測(cè)因子：為了估計(jì)癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中生存率與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系，利用“Glmnet”包的套索方法（least absolute shrinkage and selection operator,LASSO）進(jìn)行下一步篩選，使用“survival”和“survminer”包對(duì)關(guān)鍵預(yù)測(cè)因子進(jìn)行生存分析，以驗(yàn)證不同TIICs 是否與預(yù)后相關(guān)。

1.2.3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的構(gòu)建和驗(yàn)證：將符合條件的因子構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是通過(guò)回歸系數(shù)（β）加權(quán)后得出的。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的中值風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為閾值，將前列腺癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。接著使用“survminer”包進(jìn)行最佳分離統(tǒng)計(jì)，根據(jù)最佳分離將基因表達(dá)量分為高組和低組，制作Kaplan-Meier 生存曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 基于風(fēng)險(xiǎn)模型建立列線圖來(lái)預(yù)測(cè)前列腺癌患者治療無(wú)效（通過(guò)ImmuCellAI 算法得到的前列腺癌患者療效預(yù)測(cè)結(jié)果）和生存的概率；繪制隨時(shí)間變化的受試者工作特征 (receiver operating characteristic curve,ROC) 曲線，并計(jì)算ROC 曲線下的面積(area under the curve,AUC)，以驗(yàn)證列線圖的準(zhǔn)確度；利用校準(zhǔn)曲線比較基于TIICs 列線圖的預(yù)測(cè)和觀察結(jié)果，其中 45°線代表最佳預(yù)測(cè)；采用臨床決策曲線分析法判斷模型的預(yù)測(cè)可靠程度。

2 結(jié)果

2.1 前列腺組織免疫細(xì)胞分布情況以及預(yù)測(cè)因子的篩選 使用ssGSEA 量化免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)據(jù)，最后得到22 個(gè)TIICs 包括：幼稚B 細(xì)胞、記憶B 細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8+ T 細(xì)胞、幼稚CD4+ T 細(xì)胞、靜息記憶CD4+ T 細(xì)胞、激活記憶 CD4+ T 細(xì)胞、濾泡輔助性T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg 細(xì)胞）、γδ T 細(xì)胞、靜息NK 細(xì)胞、活化NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0 巨噬細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞、靜息樹(shù)突細(xì)胞、活化樹(shù)突細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。利用 LASSO 對(duì)以上22 個(gè)TIICs 進(jìn)行下一步篩選，采用交叉驗(yàn)證法估計(jì)調(diào)整參數(shù)λ，最終選擇6 個(gè)免疫細(xì)胞作為預(yù)測(cè)因子，分別為T(mén)reg細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞、激活記憶CD4+ T 細(xì)胞、靜息樹(shù)突細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。

2.2 基于免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的IRS 模型以及模型的評(píng)價(jià) 根據(jù)六個(gè)TIICs，計(jì)算樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分并根據(jù)個(gè)體預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分以中位數(shù)為臨界值分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，見(jiàn)圖1A；前列腺癌患者在治療后的生存狀況被標(biāo)記為點(diǎn)圖，見(jiàn)圖1B，隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的升高，高風(fēng)險(xiǎn)組前列腺癌患者增多，預(yù)后不良人數(shù)增多；圖1C 中還詳細(xì)列出了高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)患者之間6 個(gè)TIICs 的熱圖。利用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)患者中位總生存時(shí)間（3.8年）顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組（6.9年）（Log-Rankχ2=4.259，P＜0.001），見(jiàn)圖2。

圖1 患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布（A）、患者的生存狀態(tài)（B）以及6 種TIICs 與風(fēng)險(xiǎn)分組相關(guān)性熱圖（C）

圖2 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分組的生存曲線分析

2.3 預(yù)后列線圖模型的構(gòu)建及驗(yàn)證 基于上述對(duì)6種TIICs 分析結(jié)果構(gòu)建列線圖預(yù)測(cè)模型，結(jié)果見(jiàn)圖3。Treg 細(xì)胞86 分、M1 巨噬細(xì)胞76 分、M2 巨噬細(xì)胞55 分、激活記憶CD4+ T 細(xì)胞96 分、靜息樹(shù)突細(xì)胞49 分、嗜中性粒細(xì)胞68 分，總分430 分，對(duì)應(yīng)死亡風(fēng)險(xiǎn)為74.69%。通過(guò)ROC 曲線的繪制對(duì)模型區(qū)分度進(jìn)行評(píng)價(jià)，AUC 為0.769（95%CI：0.648～0.851，P＜0.001），C-index 為0.834，大于0.75，模型區(qū)分度較高，見(jiàn)圖4A；對(duì)預(yù)測(cè)模型的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢驗(yàn)：χ2=7.025，P=0.742，見(jiàn)圖4B；通過(guò)繪制臨床決策曲線可以看出，預(yù)測(cè)模型距極端曲線較遠(yuǎn)，當(dāng)閾概率在12%～95%時(shí)使用列線圖模型預(yù)測(cè)預(yù)后情況的凈獲益率較高，由此可見(jiàn)模型安全可靠，實(shí)用性強(qiáng)，見(jiàn)圖4C。

圖3 基于TIICs 的預(yù)后列線圖模型

圖4 預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證

2.4 治療效果列線圖模型的構(gòu)建及驗(yàn)證 采用ImmuCellAI 算法預(yù)測(cè)前列腺癌患者的治療療效，并將患者分為有效組和無(wú)效組，從圖5A 可以看出，有效組患者主要集中在預(yù)后不良的高風(fēng)險(xiǎn)組（風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分＞0），而無(wú)效組患者大多集中在低風(fēng)險(xiǎn)組（風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分＜0），由此證明IRS 免疫評(píng)分模型可作為前列腺癌患者治療效果的預(yù)測(cè)工具。此外，繪制了基于IRS 免疫評(píng)分模型預(yù)測(cè)前列腺癌患者治療效果的列線圖模型（圖5B），Treg 細(xì)胞82 分、M1 巨噬細(xì)胞84 分、M2 巨噬細(xì)胞63 分、激活記憶CD4+ T 細(xì)胞97 分、靜息樹(shù)突細(xì)胞52 分、嗜中性粒細(xì)胞45 分，總分423 分，對(duì)應(yīng)治療無(wú)效的風(fēng)險(xiǎn)為73.21%。通過(guò)ROC 曲線的繪制對(duì)模型區(qū)分度進(jìn)行評(píng)價(jià)，AUC 為0.752（95%CI：0.662～0.831，P＜0.001），C-index 為0.803，大于0.75，模型區(qū)分度較高，見(jiàn)圖6A；對(duì)預(yù)測(cè)模型的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢驗(yàn)：χ2=7.541，P=0.762，見(jiàn)圖6B；通過(guò)繪制臨床決策曲線可以看出，預(yù)測(cè)模型距極端曲線較遠(yuǎn)，當(dāng)閾概率在13%～89%時(shí)使用列線圖模型預(yù)測(cè)治療效果的凈獲益率較高，由此可見(jiàn)模型安全可靠，實(shí)用性強(qiáng)，見(jiàn)圖6C。

圖5 治療效果列線圖模型的構(gòu)建及驗(yàn)證

圖6 預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證

3 討論

前列腺癌對(duì)全世界男性的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，占男性惡性腫瘤的25%[9]。在中國(guó)，隨著超聲引導(dǎo)下前列腺穿刺活檢的應(yīng)用，前列腺癌的發(fā)病率急劇上升。與其他腫瘤相比，前列腺癌的進(jìn)展時(shí)間較長(zhǎng)，因此5年的生存率高達(dá)80%以上[10]。然而，對(duì)于晚期前列腺癌，激素剝奪療法可以通過(guò)雄激素受體信號(hào)通路暫時(shí)抑制腫瘤進(jìn)展，但有效期只有二年，進(jìn)而發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌的階段[11]。

在前列腺癌上皮中，一些免疫細(xì)胞類(lèi)型（B 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、M1 和M2 巨噬細(xì)胞）有選擇性富集，而其他類(lèi)型（肥大細(xì)胞）有選擇性消耗，表明TIICs 在前列腺癌進(jìn)展中具有復(fù)雜的生物學(xué)作用。ANDERSEN 等[12]人研究發(fā)現(xiàn)高水平的浸潤(rùn)性Treg細(xì)胞和M1，M2 巨噬細(xì)胞是術(shù)后復(fù)發(fā)的顯著不良預(yù)測(cè)因子。以往研究表明[13]，Treg 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中高度活化，其通過(guò)抑制效應(yīng)細(xì)胞活化和增殖的各種機(jī)制進(jìn)而抑制效應(yīng)細(xì)胞，例如T 效應(yīng)細(xì)胞、核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞等。還可通過(guò)分泌抗炎細(xì)胞因子（例如 TGF-β 和IL-10）抑制免疫細(xì)胞的活性，從而控制炎癥。因此在維持免疫耐受和平衡方面發(fā)揮重要作用。MENG等[14]人的研究結(jié)果表明，記憶B 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)在高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組中顯著增加，而漿細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞和活化肥大細(xì)胞浸潤(rùn)在高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組中低于低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組，與本文研究結(jié)果一致。有研究表明，前列腺癌組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中血紅素加氧酶-1表達(dá)增加可誘導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞侵襲和生長(zhǎng)，且M2 巨噬細(xì)胞水平高與腫瘤分期高和前列腺癌特異性死亡之間具有顯著相關(guān)性[15]。除此之外，M2 巨噬細(xì)胞還可以幫助建立腫瘤的免疫抑制狀態(tài)，這可能有助于解釋在較高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組中觀察到的M2 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加。相反，腫瘤中 CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)性的局部增加是預(yù)后良好的標(biāo)志，這可能解釋了在預(yù)后較好的低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組中觀察到的 CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)增加的原因。這些細(xì)胞類(lèi)型的浸潤(rùn)不僅反映了免疫微環(huán)境，還可以對(duì)前列腺癌的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)[16]。

前列腺癌中TIIC 的不同比例與臨床結(jié)果相關(guān)，本文研究發(fā)現(xiàn)激活記憶 CD4+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)在治療無(wú)效和預(yù)后不良方面有重要作用。在正常組織中，前列腺相關(guān)淋巴組織具有由CD3+ TCRαβ 組成的上皮內(nèi)白細(xì)胞，常見(jiàn)的CD8+和CD4+表型彌漫性穿透上皮。在異常情況下，與正常前列腺組織相比，免疫細(xì)胞的含量會(huì)發(fā)生改變[17]。在小鼠體內(nèi)冷凍消融模型驗(yàn)證研究中發(fā)現(xiàn)，CD8+ T 細(xì)胞在治療后廣泛浸潤(rùn)于組織中，有助于腫瘤的根除。相反，CD4+ T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加與前列腺癌診斷和前列腺癌特異性生存率差相關(guān)[18]。在LIU 等[19]人的研究中發(fā)現(xiàn)，與年輕小鼠相比，來(lái)自老年小鼠脾臟的CD4+ T 細(xì)胞具有增加的 Th17 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞因子和 Th17/Treg 比率。促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的活力、遷移和侵襲以及前列腺癌的進(jìn)展。

盡管腫瘤抗原來(lái)源于宿主，但它可以被T 細(xì)胞識(shí)別為靶標(biāo)。而T 細(xì)胞啟動(dòng)需要樹(shù)突狀細(xì)胞，它是最有效的抗原呈遞細(xì)胞。傳統(tǒng)的樹(shù)突狀細(xì)胞在發(fā)展抗腫瘤T 細(xì)胞反應(yīng)中很重要，具有高度的交叉呈現(xiàn)能力，并分泌能夠吸引CD8 T 細(xì)胞的分子，因此在促進(jìn)抗原特異性腫瘤細(xì)胞殺傷方面有重要作用。在某些腫瘤類(lèi)型中，樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)與更好的臨床結(jié)果相關(guān)。為了逃避免疫監(jiān)測(cè)，腫瘤能夠直接抑制腫瘤特異性免疫反應(yīng)或影響樹(shù)突狀細(xì)胞極化、激活、生成和組織浸潤(rùn)。此外，癌癥患者循環(huán)和浸潤(rùn)性樹(shù)突狀細(xì)胞的頻率和激活能力通常低于健康個(gè)體[20]。因此，本文中靜息樹(shù)突狀細(xì)胞的低水平浸潤(rùn)增加了預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)與以往研究結(jié)果具有一致性。

大多數(shù)前列腺癌相關(guān)死亡是由于晚期去勢(shì)抵抗性疾病的發(fā)展，通常會(huì)發(fā)展為無(wú)法治愈的骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌[21]。骨微環(huán)境中具有豐富的嗜中性粒細(xì)胞，對(duì)前列腺癌具有細(xì)胞毒性并通過(guò)靶向STAT5 直接誘導(dǎo)骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞凋亡[22]。此外，還發(fā)現(xiàn)骨髓中性粒細(xì)胞抑制骨微環(huán)境中的腫瘤生長(zhǎng)，與 T細(xì)胞免疫抑制功能無(wú)關(guān)，對(duì)于患有轉(zhuǎn)移性疾病的前列腺癌患者，升高的中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率與生存預(yù)后不良相關(guān)[23]?？傊?，這些研究揭示了嗜中性粒細(xì)胞在骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌進(jìn)展中的作用，并且利用骨中的中性粒細(xì)胞細(xì)胞毒活性可以為治療骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌提供一種新的免疫治療策略。

值得注意的是，盡管這項(xiàng)研究已盡可能避免研究中的缺陷，但仍存在一些局限性。這項(xiàng)研究是回顧性的，因此6 個(gè)免疫相關(guān)細(xì)胞預(yù)后特征的準(zhǔn)確性和有效性需要進(jìn)一步在相關(guān)臨床試驗(yàn)或其他一些公共隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究基于免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的免疫評(píng)分模型預(yù)測(cè)了前列腺癌患者的免疫治療效果和預(yù)后，發(fā)現(xiàn)通過(guò)利用在腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞的信息，有助于改善早期前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)分層以及治療后的預(yù)后分析。