劉 浩，彭 勇，尹一帆，葉 亮，陳 敏，苗靜琨

(重慶市婦幼保健院/重慶醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院兒科/新生兒篩查中心，重慶 401147)

維生素D（vitamin D,Vit D）是一種脂溶性維生素，不僅具有調(diào)節(jié)鈣磷吸收及保持骨骼健康的作用，近年來還被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分化及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[1]。對于早產(chǎn)兒，Vit D 與新生兒呼吸窘迫綜合征具有一定相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒血清25-羥維生素D[25-hydroxyvitamin D,25-(OH)D]降低是新生兒呼吸窘迫綜合征的獨立危險因素之一[2]。因此，準(zhǔn)確評估早產(chǎn)兒Vit D 水平具有十分重要的意義。

25-(OH)D 是評估人體Vit D 水平的理想標(biāo)記物。由于新生兒體內(nèi)的25-羥維生素D2[25-hydroxyvitamin D2,25-(OH)D2]濃度過低，幾乎可以忽略，因此可通過血清25-(OH)D3來衡量其體內(nèi)Vit D 水平[3]。3-epi-25- 羥維生素D3[3-epi-25-hydroxyvitamin D3,3-epi-25-(OH)D3] 是人體25- 羥維生素D3[25-hydroxyvitamin D3,25-(OH)D3] 的一個代謝產(chǎn)物，其分子式與25-(OH)D3完全相同；從空間結(jié)構(gòu)來看，3-epi-25-(OH)D3是25-(OH)D3的差向異構(gòu)體，由25-(OH)D3在肝細(xì)胞、骨細(xì)胞或皮膚細(xì)胞中差向異構(gòu)酶的作用下生成，其結(jié)構(gòu)上的差異表現(xiàn)為其C3 端的羥基發(fā)生了空間變化，由α 方向轉(zhuǎn)變?yōu)棣?方向[4]。3-epi-25-(OH)D3的下游代謝產(chǎn)物為3-epi-1α,3-epi-1α,25- 雙羥維生素 D3[3-epi-1α,25-(OH)2D3] 與1α,25- 雙羥維生素D3[1α,25-dihydroxyvitamin D3,1α,25-(OH)2D3]相比，其調(diào)節(jié)血鈣的作用明顯減弱，與Vit D受體的親和力同樣明顯減弱致使基因調(diào)節(jié)與骨代謝調(diào)節(jié)作用顯著降低，幾乎失去生理性功能[5]。因此，評估體內(nèi)Vit D 水平時需要區(qū)分25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3。

目前，臨床上檢測血清Vit D 的方法主要包括免疫分析法（簡稱免疫法）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（簡稱質(zhì)譜法）。免疫法因交叉反應(yīng)無法區(qū)分25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3；而質(zhì)譜法如果沒有經(jīng)過充分的色譜分離同樣不能區(qū)分25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3，兩種方法均可造成Vit D 檢測發(fā)生誤差[6]。近年來，雖然應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測25-(OH)D 越來越廣泛，但多數(shù)實驗室在檢測25-(OH)D3時并沒有分離3-epi-25-(OH)D3，無法達(dá)到準(zhǔn)確評估Vit D 的目的。因此，本研究擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測新方法（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）技術(shù)，在充分分離3-epi-25-(OH)D3的基礎(chǔ)上建立同時準(zhǔn)確定量檢測血清25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3的方法，并在早產(chǎn)兒中開展初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2021～2022年重慶市婦幼保健院新生兒科住院早產(chǎn)兒血液樣本共134 例，其中男性79 例，女性55 例；孕周20～36 周；年齡2～31天；體重820～2 810 g。納入研究的早產(chǎn)兒均未補充25-(OH)D3制劑。本研究已通過重慶市婦幼保健院倫理委員會審查批準(zhǔn)，批號（2022）倫審（科）027 號。

1.2 儀器與試劑 UPLC-MS/MS 儀（美國Waters 公司的UPLC Xevo TQS）；純水儀（美國Millipore 公司的Synergy UV）；色譜柱（Shim-pack Velox PFPP,2.1 mm × 100 mm,1.8 μm）（日本島津公司）；25-(OH)D3標(biāo)準(zhǔn)品及其同位素內(nèi)標(biāo)d6-25-(OH)D3（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司）；3-epi-25-(OH)D3標(biāo)準(zhǔn)品及其同位素內(nèi)標(biāo)d6-3-epi-25-(OH)D3（加拿大Toronto Research Chemicals 公司）；空白基質(zhì)血清來自華大公司脂溶性維生素試劑盒；色譜級甲醇與異丙醇[霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司]；正己烷（成都市科隆化學(xué)品公司）。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制：標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)干粉用甲醇溶解形成高濃度儲存液，然后再用甲醇配制為相應(yīng)濃度的工作液，-80℃保存?zhèn)溆?。?biāo)準(zhǔn)曲線配制：用空白基質(zhì)溶液，采用倍比稀釋法配制8 點標(biāo)準(zhǔn)曲線，25-(OH)D3標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度分別為3.75，7.50，15.00，30.00，60.00，120.00，240.00 和480.00 nmol/L；3-epi-25-(OH)D3標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度分別為1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00，64.00 和128.00 nmol/L。內(nèi)標(biāo)沉淀劑為甲醇與異丙醇以8∶2 的比例配制，d6-25-(OH)D3與d6-epi-25-(OH)D3的濃度均為25.00 nmol/L。質(zhì)控品配制：用空白基質(zhì)溶液配制低、中、高三個濃度的質(zhì)控品，25-(OH)D3為5.00，50.00與200.00 nmol/L；3-epi-25-(OH)D3為1.25，5.00 與20.0 0nmol/L。

1.3.2 樣品前處理：取100 μl血清于1.5 ml EP管中，加入200 μl 內(nèi)標(biāo)沉淀劑，旋渦震蕩3 min 后加入1 ml 正己烷，再旋渦震蕩3 min，然后19 000×g 4℃離心5 min，取上清，室溫下氮氣吹干，加入80 μl 50%（v/v）甲醇水復(fù)溶液，混勻后上機(jī)檢測。

1.3.3 色譜及質(zhì)譜條件：流動相A 為0.1%（v/v）甲酸水，B 相為0.1%（v/v）甲酸-甲醇。梯度洗脫條件：0～0.5min 為50%（v/v）B 相，0.5～7.5min由50% 均速升高至98%B 相，7.5～7.51min 為50%B 相，保持98%B 相至8min，流速0.4 ml/min。柱溫溫度為45℃，進(jìn)樣量10 μl。采用大氣壓化學(xué)電離正離子（atmospheric pressure chemical ionization positive mode,APCI+）模式進(jìn)行電離，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring,MRM）模式進(jìn)行采集，離子源電壓550 V，離子源溫度150℃。各種化合物的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 待測化合物的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)

1.3.4 方法學(xué)驗證：建立的UPLC-MS/MS 檢測法分別從最低定量限（lower limit of quantification,LLOQ）、線性關(guān)系、精密度與準(zhǔn)確度等四個方面進(jìn)行驗證。最低定量限的信噪比大于10 且變異系數(shù)（coefficienct of variation,CV）≤20.00%為滿足要求；線性關(guān)系以相關(guān)系數(shù)r2≥0.99 為滿足要求；精密度以相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation,RSD）＜15.00%為滿足要求；準(zhǔn)確度以回收率在±15.00%以內(nèi)為滿足要求[7]。

1.3.5 早產(chǎn)兒血清25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3檢測：早產(chǎn)兒于住院期間采集約1 ml 靜脈血，樣本離心后（2 000 r/min）分離血清，-80 ℃保存。采用新建方法檢測早產(chǎn)兒血清25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3；總25-(OH)D3濃度為25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3濃度之和。參照《2016年全球營養(yǎng)性佝僂病管理共識》及《2021 中國兒童維生素A、維生素D 臨床應(yīng)用專家共識》提出的兒童Vit D 應(yīng)用狀況判斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究以血清25-(OH)D3濃度小于30.00 nmol/L 為缺乏；30.00～50.00 nmol/L 為不足；大于50.00 nmol/L 為適宜[8-9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Excel 軟件與SPSS11.0 統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；率的比較采用兩組率比較的卡方檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 25 -(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3的色譜圖 見圖1。25-(OH)D3，3-epi-25-(OH)D3及同位素內(nèi)標(biāo)的保留時間為5.34 min 和5.44 min，總分析時間8.0 min。25-(OH)D3與d6-25-(OH)D3的定量離子對為383.41＞211.27 與389.48＞371.43；3-epi-25-(OH)D3與d6-3-epi-25-(OH)D3的定量離子為383.43＞365.41與389.47＞371.45。

圖1 25-(OH)D3，3-epi-25-(OH)D3 及其同位素內(nèi)標(biāo)的色譜圖

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 LLOQ 及線性關(guān)系：25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3的LLOQ 見表2。25-(OH)D3線性范圍3.75～480.00 nmol/L，相關(guān)系數(shù)r2=0.991 1；3-epi-25-(OH)D3的線性范圍1.00～128.00 nmol/L，相關(guān)系數(shù)r2=0.992 8。

表2 25-OH D3 與3-epi-25-(OH)D3 的最低定量限

2.2.2 日內(nèi)精密度與日間精密度：見表3。25-(OH)D3低、中、高三個濃度質(zhì)控品的日內(nèi)及日間精密度均小于15.00%；3-epi-25-(OH)D3低、中、高三個濃度質(zhì)控品的日內(nèi)及日間精密度同樣均小于15.00%。

表3 25-(OH)D3 與3-epi-25-(OH)D3 的日內(nèi)與日間精密度分析

2.2.3 準(zhǔn)確度：見表4。25-(OH)D3低、中、高三個濃度質(zhì)控品的回收率分別為109.92%，102.25%和98.76%；3-epi-25-(OH)D3低、中、高三個濃度質(zhì)控品的回收率分別為97.75%，95.25% 和99.80%。

表4 25-(OH)D3 與3-epi-25-(OH)D3 的準(zhǔn)確度分析

2.2.4 血清25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3檢測結(jié)果：早產(chǎn)兒血清25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3檢測結(jié)果見表5。分別以25-(OH)D3與總25-(OH)D3評估早產(chǎn)兒血清Vit D 水平，及二者Vit D 缺乏率與充足率的比較見表6。

表5 早產(chǎn)兒血清25-(OH)D3 與3-epi-25-(OH)D3 的濃度分析（n=134,±s,nmol/L）

表5 早產(chǎn)兒血清25-(OH)D3 與3-epi-25-(OH)D3 的濃度分析（n=134,±s,nmol/L）

類 別25-(OH)D33-epi-25-(OH)D3 總25-(OH)D33-epi-25-(OH)D3 /總25-(OH)D3(%)平均值20.28±12.555.68±4.8525.78±15.5521.94±12.86范圍2.33～70.880.00～24.732.33～90.850.00～60.62

表6 早產(chǎn)兒Vit D 水平的評估分析

3 討論

目前，臨床上應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測血清Vit D 常采用C18 色譜柱進(jìn)行色譜分離，然而C18 色譜柱存在無法分離25-(OH)D3及其差向異構(gòu)體3-epi-25-(OH)D3的問題[10]。本研究采用五氟苯基丙基（pentafluorophenylpropyl,PFPP）色譜柱，在流動相甲醇的梯度作用下，8 min 內(nèi)可對25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3進(jìn)行充分分離，從而達(dá)到準(zhǔn)確檢測血清25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3濃度的目的。PFPP 色譜柱以五氟苯基丙基為鍵合基團(tuán)，提供了與C18 固定相不同的結(jié)合方式，苯環(huán)上的氟原子可增強鍵合相與分析物之間的π-π 相互作用，從而提高對分析物的選擇性和保留，使25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3完全分離[11]。

本研究基于UPLC-MS/MS 技術(shù)，建立了準(zhǔn)確定量檢測血清25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3的方法。該方法具有較廣的線性范圍和較低的定量限（1.48±0.20 ng/ml）。研究報道，采用液液萃取法，3-epi-25-(OH)D3的定量限可達(dá)3.50 nmol/L；采用蛋白沉淀法可達(dá)2.75 nmol/L；采用固相萃取法可達(dá)0.75 nmol/L[12]。本研究的定量限低于既往研究的液液萃取法與蛋白沉淀法，略高于固相萃取法，可能與近年來質(zhì)譜儀靈敏度不斷提高有關(guān)。精密度與準(zhǔn)確度方面，其RSD 與回收率均小于15.00%，完全滿足液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法學(xué)驗證的要求，具有良好的性能[7]；同時，該方法能完全分離25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3，排除了3-epi-25-(OH)D3干擾，達(dá)到了準(zhǔn)確定量的目的。

采用新建方法，本研究對134 例早產(chǎn)兒血清25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示早產(chǎn)兒在未補充25-(OH)D3的情況下，其濃度水平較低，僅為22.35±13.28 nmol/L，Vit D 缺乏率高達(dá)78.36%，不足率19.40%，而充足率僅2.24%。原婷等[13]對大連市158 例早產(chǎn)兒在出生后24h 內(nèi)采用化學(xué)發(fā)光法檢測了25-(OH)D，25-(OH)D 的平均濃度43.00±18.50 nmol/L，66.50%的早產(chǎn)兒存在Vit D 缺乏（＜ 50.00 nmol/L）。黃麗密等[14]對溫州市424 例早產(chǎn)兒出生后2 周的25-(OH)D 水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)35.80%的早產(chǎn)兒處于Vit D 缺乏（12.50 nmol/L～37.50 nmol/L），30.70%的早產(chǎn)兒處于Vit D 不足（37.50 nmol/L～50.00 nmol/L）。JUNG 等[15]對韓國早產(chǎn)兒在出生時檢測了Vit D，發(fā)現(xiàn)25-(OH)D 的濃度為45.50±33.75 nmol/L，Vit D 缺乏率82.80%?？梢?，Vit D 缺乏或不足在早產(chǎn)兒中非常普遍，然而各個實驗室檢測的Vit D 平均濃度、Vit D 缺乏率與不足率卻存在差異，這可能與納入胎齡不同，Vit D 缺乏標(biāo)準(zhǔn)不一及是否補充Vit D 制劑等因素有關(guān)。此外，不同實驗室所采用的檢測方法同樣存在差異，或為免疫法，或為采用C18 色譜柱的串聯(lián)質(zhì)譜法，而上述方法均不能排除3-epi-25-(OH)D3的干擾，從而導(dǎo)致研究結(jié)果產(chǎn)生差異。

本研究中的130 例（97.00%）早產(chǎn)兒血清中均檢測到了3-epi-25-(OH)D3，4 例未檢測到，最高值24.73 nmol/L，平均濃度5.68±4.85 nmol/L；3-epi-25-(OH)D3占總25-(OH)D3的比例為21.94%±12.86%，最高可達(dá)60.62%。OOMS 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，在出生時91.50%的早產(chǎn)兒體內(nèi)均能檢測到3-epi-25-(OH)D3濃度水平較低，平均3.00 nmol/L，濃度范圍1.00 nmol/L～7.00 nmol/L，小于10.00%總25-(OH)D3；在補充了25-(OH)D3之后，3-epi-25-(OH)D3的占比增加為15.00%～55.00%。HANSON 等[5]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，新生兒出生時3-epi-25-(OH)D3的平均濃度較低，為3.25 nmol/L，僅占總25-(OH)D3的7.21%；在出生后第四周，隨著25-(OH)D3濃度的增加，3-epi-25-(OH)D3的平均濃度升高至38.75±22.50 nmol/L，占比達(dá)到41.70%。總的來說，新生兒期3-epi-25-(OH)D3的血清濃度較低，但隨著25-(OH)D3濃度的增加，3-epi-25-(OH)D3的生成與占比均會增加，這可能與早產(chǎn)兒或新生兒在生命早期時肝臟未完全發(fā)育成熟有關(guān)。本研究中，3-epi-25-(OH)D3的濃度略高于上述兩項研究，可能與納入早產(chǎn)兒的年齡較大，3-epi-25-(OH)D3隨年齡逐漸增高有關(guān)。

在3-epi-25-(OH)D3影響下，本研究早產(chǎn)兒的Vit D 缺乏率下降了12.69%，Vit D 充足率升高了6.21%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，對Vit D 的評估產(chǎn)生了誤判。AGHAJAFARI 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，在排除3-epi-25-(OH)D3時，80.00%的新生兒Vit D 存在不足（＜75.00 nmol/L）；而沒有排除3-epi-25-(OH)D3時，新生兒Vit D 的不足率顯著下降至73.00%。MYDTSKOV等[18]同樣發(fā)現(xiàn)在嬰兒早期，如果不排除3-epi-25-(OH)D3的干擾，可導(dǎo)致對8.00%的嬰兒Vit D 評估產(chǎn)生錯誤（＜75.00 nmol/L），從而引起誤判。本研究結(jié)果與上述報道相似，由此可見，評估新生兒Vit D 水平應(yīng)當(dāng)將3-epi-25-(OH)D3排除從而達(dá)到精準(zhǔn)評估的目的。

綜上所述，本研究基于LC-MS/MS 技術(shù)建立了同時準(zhǔn)確定量檢測血清25-(OH)D3與3-epi-25-(OH)D3濃度的新方法，避免了既往方法存在差向異構(gòu)體3-epi-25-(OH)D3對25-(OH)D3造成干擾的不足，達(dá)到了準(zhǔn)確檢測早產(chǎn)兒Vit D 濃度的目的，對早產(chǎn)兒Vit D 精準(zhǔn)評估具有十分現(xiàn)實的應(yīng)用價值。