羅亞麗，黃志剛，羅思通，徐 洲 （.巴中市巴州區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，四川巴中 66000；.四川大學華西醫(yī)院實驗醫(yī)學科，成都 6004；.四川錦欣婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 60066）

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是妊娠中晚期一種常見的并發(fā)癥，其主要表現(xiàn)有肝功能異常、黃疸以及皮膚瘙癢等癥狀[1-2]。ICP 病因較為復雜，其發(fā)病機制目前尚不十分明確，可能與雌激素水平、遺傳以及環(huán)境等因素有關(guān)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，ICP 對孕婦和胎兒預后影響較大，可導致母體并發(fā)癥增多及胎兒宮內(nèi)窘迫、胎兒早產(chǎn)以及新生兒窒息等妊娠結(jié)局不良[4]。程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是一類與細胞凋亡有關(guān)的新基因，廣泛表達于多種器官和組織。研究表明[5-7]PDCD4 參與多種腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展，可調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的侵襲與凋亡。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporter，GLUT）是調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運以及胰島素的分子，已有研究證實GLUT 在胎盤組織中的異常表達與妊娠期疾病密切相關(guān)[8]。目前關(guān)于PDCD4 與GLUT 在ICP 中的研究鮮有報道，因此本研究旨在探討孕婦血清PDCD4 與GLUT 在ICP中的表達以及二者與妊娠結(jié)局的相關(guān)性，以期為ICP 的臨床診治提供生物檢測指標。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年7月～2020年7月收治并在巴州區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科分娩的ICP 孕婦126例作為研究組，年齡22～37(26.99±2.54)歲；孕周≤34 周為62 例，＞34 周為64 例；平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）26.17±1.56 kg/m2；孕次1～4(2.41±0.25)次。納入標準：①符合2015 版《妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥診療指南》[9]；②孕婦首次確診為ICP；③臨床上為輕度皮膚瘙癢；④患者均為初次妊娠；⑤資料完整。排除標準：①有嚴重妊娠期并發(fā)癥者；②肝功能異常者；③感染或并發(fā)有其他皮膚病者；④有其他心、肝、腎臟嚴重疾病者；⑤自身免疫缺陷者。選擇同期我院120 例健康產(chǎn)檢孕婦作為對照組，年齡20～35(26.54±3.41)歲；孕周36～40(38.14±1.76) 周；平均BMI 25.98±2.43kg/m2；孕次1～4（2.37±0.18）次，兩組基本資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（P=1.424,0.733,1.600,P＞0.05），具有可比性。本研究只納入非人工授精者。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會的批準（批號：18-625）。

1.2 試劑與儀器 生化指標檢測：總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒（上海名勁生物科技有限公司，貨號：B3452）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）試劑盒（上海酶研生物科技有限公司，貨號：EK-H12224）；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司，貨號：180）。qRT-PCR 儀（美國Bio-Rad 公司型號：CFX384）；TRIzol 試劑（上海佰利萊生物科技有限公司，貨號：BLL-Bytd0054）；熒光定量PCR 試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，貨號：23444）；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京普非生物科技有限公司，貨號：PR2555）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：采集ICP 孕婦以及健康分娩孕婦清晨空腹時靜脈血5ml，4 000 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，分離血清，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 臨床資料采集及生化指標檢測：收集所有受試者孕婦不良妊娠結(jié)局資料包括：自發(fā)性早產(chǎn)、產(chǎn)后出血、羊水胎糞污染、宮內(nèi)窘迫、小于胎齡兒（體重小于同胎齡兒平均體重的第5 個百分位）、低出生體重兒[10]。TBA，ALT，AST 生化指標檢測采用全自動生化分析儀（cobas c 311，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）檢測。根據(jù)孕婦空腹血清TBA 水平分成[11]：輕度ICP 組（TBA 水平為10～40 μmol/L，n=46）和重度ICP 組（TBA＞40 μmol/L，n=80）。

1.3.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測血清PDCD4，GLUT1 表達水平：使用TRIzol 試劑提取血清樣本中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進行qRTPCR 反應，qRT-PCR 檢測條件：95℃預變性5 min，95℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸15s，共循環(huán)35 次。以β-actin 為內(nèi)源對照，以2-ΔΔCt的方法計算PDCD4 和GLUT1 的表達水平。引物由上海吉凱基因技術(shù)有限公司完成，引物序列：PDCD4 正向引物5’-GCAAAAAGGCGACTAAGGAAAAA-3’，反向引物5’-GGCATCAACGCTGTCTTCTAT-3’；GLUT1 正向引物5’- TAAGGGCGTCACTCCCACT-3’，反向引物5’- CACAAACAGCGACACGACAGT-3’；β-actin 正向引物5’- GAAGATCAAGATCATT GCTCCT-3’，反向引物5’- TACTCCTGCTTGCTGA TCCACA -3’。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用例（n）或百分比（%）表示，組間比較采用卡方（χ2）檢驗；多因素Logistic 回歸分析影響ICP 孕婦妊娠結(jié)局的因素；Pearson 法分析PDCD4，GLUT1 水平的相關(guān)性。P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組與對照組生化指標以及血清PDCD4，GLUT1 水平比較 研究組TBA（65.25±5.87μmol/L），ALT（54.52±3.66U/L），AST（49.98±4.58U/L），PDCD4（1.36±0.23），GLUT1（1.40±0.22）水平均高于對照組（3.52±0.13μmol/L，20.87±2.15 U/L，18.46±3.45 U/L，1.02±0.21，0.99±0.18），差異具有統(tǒng)計學意義（t=115.161，83.371，60.741，12.090，15.953，均P=0.000）。

2.2 重度ICP 與輕度ICP 患者生化指標以及血清PDCD4，GLUT1 水平比較 重度ICP 組TBA（86.02±7.26μmol/L），ALT（72.57±4.51U/L），AST（65.84±5.41U/L），PDCD4（1.41±0.25），GLUT1（1.45±0.22） 水平均高于輕度ICP 組（29.14±3.45μmol/L，23.14±2.18 U/L，22.41±3.15 U/L，1.27±0.20，1.31±0.21），差異具有統(tǒng)計學意義（t=49.932，69.714，49.761，3.246，3.496；P=0.000，0.000，0.000，0.002，0.001）。

2.3 研究組與對照組妊娠結(jié)局比較 見表1。研究組羊水胎糞污染、自發(fā)性早產(chǎn)、產(chǎn)后出血、宮內(nèi)窘迫等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率均高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=1.049～29.159，均P＜0.05）。研究組總的妊娠結(jié)局明顯高于對照組[60(47.61%) vs 10(8.33%)]，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=45.596,P=0.000)。

表1 研究組與對照組妊娠結(jié)局比較[n（%）]

2.4 ICP 妊娠結(jié)局良好和妊娠結(jié)局不良患者一般資料及血清PDCD4，GLUT1 比較 見表2。以PDCD4 均數(shù)為臨界值進行劃分，將≤1.36 的患者納入低表達，＞1.36 的患者納入高表達；以GLUT1均數(shù)為臨界值進行劃分，將≤1.40 的患者納入低表達，＞1.40 的患者納入高表達，結(jié)果顯示妊娠結(jié)局良好組和妊娠結(jié)局不良組患者的發(fā)病程度、PDCD4，GLUT1 表達水平差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表2 ICP 妊娠結(jié)局良好和妊娠結(jié)局不良患者各指標比較[n（%）]

2.5 多因素Logistic 回歸分析影響ICP 孕婦妊娠結(jié)局的因素 見表3。以ICP 孕婦妊娠結(jié)局不良為因變量（妊娠結(jié)局不良=1，妊娠結(jié)局良好=0），以發(fā)病程度（輕度=0，重度=1），PDCD4（低表達=0，高表達=1），GLUT1（低表達=0，高表達=1）表達水平為自變量進行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示發(fā)病程度、PDCD4，GLUT1 為ICP孕婦妊娠結(jié)局不良的影響因素（均P＜0.05）。

表3 多因素Logistic 回歸分析影響ICP 孕婦妊娠結(jié)局的因素

2.6 Pearson 相關(guān)性分析研究組血清PDCD4，GLUT1 水平的相關(guān)性 Pearson 相關(guān)性分析研究組血清PDCD4 與GLUT1 水平呈正相關(guān)（r=0.460，P＜0.05）。

3 討論

ICP 是一種妊娠期婦女肝臟損傷的常見病因，可增加胎兒窘迫、羊水糞染、早產(chǎn)的發(fā)生率，甚至可造成死胎、死產(chǎn)，影響出生人口質(zhì)量。由于ICP發(fā)病機制復雜，后期若處理不當，將會對產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒的生命等造成較大的威脅，因此及早檢測以及盡早發(fā)現(xiàn)對于預防和診治ICP 有重大意義。目前對于ICP 的診斷，國際上尚無統(tǒng)一意見。研究表明，TBA 對于ICP 的診斷價值較高，另外當ICP患者肝功能出現(xiàn)不同程度的炎性反應時，多數(shù)患者ALT，AST 會呈現(xiàn)不同程度的升高趨勢，進而對孕婦以及胎兒造成嚴重的不良影響[12-14]。臨床試驗和觀察性研究的證據(jù)均顯示，當孕婦的血清TBA 濃度高于實驗室界定的臨界上限值后，其疾病的嚴重程度與圍產(chǎn)期不良妊娠結(jié)局風險增加相關(guān)，如死產(chǎn)、早產(chǎn)、羊水胎糞污染、胎兒窘迫、胎兒窒息等[15]。本研究ICP 患者TBA，ALT，AST 水平顯著高于對照組，與王之萍等[16]的研究結(jié)果相似。分析其原因可能是TBA 水平升高時，影響了胎盤功能，胎盤血流受阻，同時胎兒的血流灌注減少及血氧供應不足，導致孕婦妊娠結(jié)局不良。

PDCD4 是一種重要的抑癌基因，近年來研究發(fā)現(xiàn)其參與了許多疾病的病理、生理過程，尤其是在炎癥反應和細胞死亡過程中發(fā)揮重要作用[17]。有報道稱miR-21 可靶向PDCD4 調(diào)控胎盤滋養(yǎng)細胞的侵襲和凋亡[18]。FENG 等[19]研究表明PDCD4 主要在滋養(yǎng)細胞胞質(zhì)（細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞）中，PDCD4 在ICP 胎盤組織中的表達高于健康對照組，miR-21-5p 的敲低增加了下游基因PDCD4 的表達，增加了細胞凋亡。本研究中PDCD4 在ICP 患者血清中表達水平顯著高于對照組，且ICP 重度組高于ICP 輕度組，與前人研究結(jié)果一致，提示了PDCD4 可能促進了胎盤滋養(yǎng)細胞的過度凋亡，對妊娠中晚期孕婦的健康造成一定的威脅。GLUT1 作為葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族成員之一，是介導細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的重要載體，其作用是參與葡萄糖跨膜運輸正常的生理過程。研究表明GLUT1 在胎盤滋養(yǎng)細胞的基底膜和微絨毛中均有表達[20]，胎盤組織中GLUT1 的表達升高可能是因為母體胎盤缺氧導致，但其具體機制尚不清楚[21]。景曉琳等[22]研究了miR-148b-3p 調(diào)節(jié)胎盤滋養(yǎng)細胞GLUT1 表達與ICP 子代糖代謝紊亂關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GLUT1 蛋白在人滋養(yǎng)細胞中表達上調(diào)，胎盤組織GLUT1表達上調(diào)可能與受體內(nèi)母體高葡萄糖水平、胎盤缺氧有關(guān)。本研究中GLUT1 在ICP 患者血清中的水平顯著高于對照組，重度ICP 組GLUT1 水平高于輕度ICP 組，提示GLUT1 參與了ICP 的發(fā)生和發(fā)展，其動態(tài)變化可反映患者的疾病嚴重程度，可能與孕婦胎盤缺氧有關(guān)。

本研究多因素Logistic 回歸分析顯示發(fā)病程度、PDCD4，GLUT1 是影響ICP 孕婦妊娠不良結(jié)局的危險因素，提示ICP 患者中PDCD4，GLUT1 的異常表達與不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)。陳昀等[23]研究發(fā)現(xiàn)GLUT1 蛋白水平相對較高，可能與糖酵解因素有關(guān)。蘇瑞芬等[24]研究了PDCD4 在子癇前期患者胎盤組織中的表達情況，結(jié)果顯示，PDCD4表達水平在子癇前期患者胎盤組織中表達上調(diào)，且與胎盤螺旋動脈重鑄發(fā)生密切相關(guān)，并表明了PDCD4 表達升高會加劇滋養(yǎng)細胞凋亡，滋養(yǎng)細胞與腫瘤細胞的侵襲能力相似。當胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡過多時會導致侵襲不足，引起孕婦胎盤功能受損。Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PDCD4，GLUT1 水平呈正相關(guān)，提示PDCD4，GLUT1 可能發(fā)揮協(xié)同作用共同參與ICP 的發(fā)生。

綜上所述，ICP 孕婦血清中PDCD4，GLUT1水平均升高，二者的異常表達對孕婦妊娠結(jié)局產(chǎn)生不良影響，可作為臨床ICP 孕婦妊娠結(jié)局的預測指標，對可能出現(xiàn)妊娠結(jié)局不良的患者應盡早干預。本研究的局限性在于所研究的樣本量有限，且對于血清PDCD4，GLUT1 水平對ICP 的具體作用機制尚不十分清楚，后期仍需要進一步擴大樣本數(shù)量深入探討二者在ICP 孕婦中的發(fā)病機制，為ICP 的診斷和鑒別提供新的理論依據(jù)和方向。