楊 柳，付 欣，張小飛（西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，西安 710061）

B 族鏈球菌（group B Streptococcus，GBS）又稱為無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），是一種革蘭陽性兼性厭氧鏈球菌，通常定植于女性生殖道和胃腸道。妊娠期攜帶GBS 可導致孕婦早產(chǎn)、胎膜早破、產(chǎn)褥期感染等不良妊娠結(jié)局[1]。若不進行及時的干預治療，約50%攜帶GBS 的孕婦會將此菌傳播給胎兒，引發(fā)新生兒早發(fā)型GBS 病，導致嚴重的敗血癥和腦膜炎甚至死亡。因此，GBS在國際圍產(chǎn)醫(yī)學中具有不可忽視的地位。莢膜多糖作為GBS 的主要毒力因子，其血清型通常用于菌株表征、疫苗開發(fā)及對人類GBS 流行病學的研究[2]。GBS 血清型分型和耐藥基因攜帶率存在明顯的地理差異，本文旨在了解西安地區(qū)胎膜早破孕婦生殖道GBS 血清型分型、抗生素耐藥性和耐藥基因攜帶情況，指導臨床醫(yī)生合理用藥，避免耐藥株的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2020年1月～2021年12月西北婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)科分娩的50 例胎膜早破孕婦生殖道分離的GBS 菌株。納入標準：①符合胎膜早破診斷標準[3]；②符合《預防圍產(chǎn)期B族鏈球菌病（中 國）專家共識》[4]；③產(chǎn)婦年齡在 20～45 歲之間，孕周36～41 周。排除標準：①有嚴重感染的患者；②并發(fā)嚴重妊娠并發(fā)癥的患者；③并發(fā)內(nèi)科疾病的孕婦。本研究獲得所有產(chǎn)婦知情同意，符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 儀器與試劑 VITEK2 compact 全自動微生物分析系統(tǒng)及配套的鑒定卡和藥敏卡片（法國梅里埃）；5%（v/v）綿羊血瓊脂平板（環(huán)凱生物）；藥敏紙片（溫州康泰）；細菌基因組DNA 提取試劑盒（天根生物，DP302）；引物由上海生工生物公司合成；PCR 擴增儀（美國賽默飛ABI-7500）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：采用一次性無菌陰道拭子，在孕婦陰道下段1/3 處旋轉(zhuǎn)1 周，收集陰道黏膜分泌物標本，置于無菌試管送檢。

1.3.2 GBS 分離鑒定及藥敏試驗：根據(jù)第四版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行菌株鑒定及藥物敏感性試驗，質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC 49619。

1.3.3 紅霉素及克林霉素耐藥表型篩選試驗：參照2016 版CLSI M100 S26 對紅霉素和/或克林霉素耐藥的GBS 采用雙紙片擴散法進行耐藥表型篩查試驗，0.5 麥氏單位的GBS 菌液均勻涂布于綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上，將15μg 紅霉素和2 μg 克林霉素貼在相鄰的位置，間距12 mm，5ml/dl CO2培養(yǎng)箱35℃孵育20～24h。結(jié)果判讀：在紅霉素相鄰側(cè)克林霉素抑菌圈邊緣出現(xiàn)截平（似大寫的D 字形），為誘導型克林霉素耐藥（iMLS），報告D 試驗陽性，應將克林霉素修正耐藥報告；若對紅霉素和克林霉素均耐藥，為結(jié)構(gòu)型耐藥（cMLS）；對紅霉素耐藥，對克林霉素敏感且D 試驗陰性，為M 型耐藥；對克林霉素耐藥，對紅霉素敏感，為L 型耐藥。

1.3.4 GBS 血清型分型：采用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取GBS 分離株的DNA 作為PCR 模板，針對GBS 的10 個血清型從文獻中選取11 對引物[5]（其中2 對引物針對同一血清型，以驗證其準確性），采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)進行核酸擴增，確定不同GBS 分離株的血清型。多重PCR 反應體系包括：10×PCR 緩沖液2.5 μl，MgCl22 mmol，dNTP 200 μmol，引物250 nmol（其中引物1 和16 濃度為400 nmol），DNA Taq 聚合酶0.3 U，5 μl DNA 模板，加無核酸酶水至25 μl。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性60 s，54 ℃退火60s，72 ℃延伸2 min，15 個循環(huán)；再95℃變性60 s，56℃退火60 s，72℃延伸2 min，25 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。4℃保存。擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。引物見表1。

表1 GBS 血清型檢測多重PCR 引物

1.3.5 耐藥基因檢測：采用普通PCR 方法對紅霉素和左氧氟沙星耐藥的GBS 分離株進行耐藥基因檢測（ermB，ermTR，mefA/E 和gyrA，gyrB，parC，parE）。模板DNA 提取方法同上，選取8 對引物[3]見表2。反應體系包括：模板DNA 1.25 μl，10×PCR 緩沖液 2.5 μl，MgCl21.5 μl，上下游引物各1 μl，dNTP 0.5 μl，DNA Taq 酶0.25 μl，無核酸酶水補充到25 μl。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，共35 個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

表2 GBS 抗生素耐藥基因檢測PCR 引物

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0 軟件進行分析。計數(shù)資料采用率(%)進行統(tǒng)計學描述。

2 結(jié)果

2.1 GBS分離株血清型分布和耐藥情況 見表3。50株GBS 分離株中檢測到4 種血清型，主要為Ⅲ型（24株，48.0%），其次為Ⅰb 型（12 株，24.0%），Ⅰa 型（10 株，20.0%）和Ⅴ型（4 株，8.0%）。藥敏結(jié)果顯示：所有GBS 分離株對青霉素、頭孢曲松、萬古霉素和利奈唑胺的敏感度為100%，對紅霉素、克林霉素和左氧氟沙星的耐藥率分別為 80.0%，74.0%和 56.0%。

表3 胎膜早破患者GBS 分離株的耐藥率［n=50，n (%)］

2.2 紅霉素及克林霉素耐藥表型研究 見表4。80%GBS 分離株對紅霉素耐藥，耐藥表型主要為cMLS 型（34/40，85.0%），其次為M 型（4/40，10.0%）和iMLS 型（2/40，5.0%）。紅霉素耐藥中血清型III 型最為常見。

表4 40 株紅霉素耐藥GBS 分離株的耐藥表型［n (%)］

2.3 GBS 分離株耐藥基因研究 見表5。40 株紅霉素耐藥株檢測到 5 種基因型，主要為ermB 和ermB+mef（A/E）（33/40，82.5%）基因型。cMLS型耐藥株主要攜帶ermB 基因，所有M 型耐藥株均攜帶mef（A/E）基因，所有iMLS 分離株均攜帶ermTR 基因。

表5 40 株紅霉素耐藥GBS 分離株的耐藥基因型［n(%)］

2.4 28 株左氧氟沙星耐藥GBS 分離株的耐藥基因型 見表6。28 株左氧氟沙星耐藥株檢測到4 種基因型，包括gyrA，partC，gyrA+partC 及gyrA+partC +partE 。分離株對左氧氟沙星的抗性主要與gyrA+ partC 和gyrA+partC+partE（26/28，92.9%）有關(guān)。

表6 28 株左氧氟沙星耐藥GBS 分離株的耐藥基因型［n (%)］

3 討論

胎膜早破是最常見的孕產(chǎn)婦并發(fā)癥，而細菌感染是引起胎膜早破的重要致病因素[6]。有研究表明，GBS 對絨毛有強大的吸附能力和穿透能力，定植于女性生殖道和宮頸的GBS 可通過產(chǎn)生多種炎癥因子引發(fā)炎癥反應使胎膜局部張力降低，從而導致胎膜早破，繼而引發(fā)宮內(nèi)感染[7]。根據(jù)細胞壁上特異性的S 物質(zhì)，可將GBS 細分為10 個血清型：Ia，Ib，II-IX 等[8]。血清型與致病性之間存在相關(guān)性，血清型III 和Ia 是孕婦GBS 全身性感染的常見型，其次為V 和 Ib 型[9-10]。本研究中，血清型III 是胎膜早破孕產(chǎn)婦生殖道GBS 的主要血清型（48%），與Ⅰa,Ⅰb 和V 型共占GBS 分離株的94%，這一數(shù)據(jù)與全球評估的數(shù)據(jù)接近：Ia，Ib，II，III 和V占所有血清型的98%[11]，未見血清型Ⅳ，Ⅵ，Ⅷ或Ⅸ型，這幾種血清型在其他亞洲人群GBS 的相關(guān)研究中同樣比較罕見。不同的血清型（和亞型）分布于不同的宿主，疾病狀態(tài)和地理分布有關(guān)[12]。血清型III 是常見的侵襲性菌株，有較強的血腦屏障穿透能力，新生兒晚發(fā)型腦膜炎多與其有關(guān)；此外，人群中血清型V 患病率的增加可能會對疾病發(fā)生率產(chǎn)生影響，通常與成人侵襲性疾病、新生兒膿毒癥和孕婦感染有關(guān)[13]。在中美洲和東南亞，血清III 型發(fā)生率分別為11%和12%；在中國長沙和東莞地區(qū)有關(guān)報道，血清III 型患病率更高，分別為60%和54.9%；而沈陽地區(qū)，最常見的血清型不是血清型III 而是Ia[14]。由于GBS 血清型與侵襲性疾病和疫苗開發(fā)的潛在相關(guān)性，了解不同地區(qū)GBS不同血清型的流行情況，有助于疫苗開發(fā)和接種策略的實施。

GBS 是全球新生兒疾病的主要原因，生產(chǎn)時抗生素預防（intrapartum antibiotic prophylaxis，IAP）可有效降低GBS 感染產(chǎn)婦不良妊娠結(jié)局和新生兒早發(fā)型感染發(fā)生率，美國疾病預防控制中心（CDC）推薦青霉素作為IAP 的首選藥物，但對于青霉素過敏的患者，紅霉素和林霉素可作為首選替代藥物。然而隨著IAP 廣泛使用，CLSI-M100 推薦治療GBS 的抗生素出現(xiàn)多耐藥現(xiàn)象。國內(nèi)一項meta 分析顯示，GBS 對青霉素、萬古霉素和利奈唑胺出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，耐藥率分別為1.6%，0.3%和0.3%。國內(nèi)各地普遍對紅霉素有很高的耐藥率，東北和華北地區(qū)GBS 的紅霉素耐藥率最高，分別為82.2%和71.5%?？肆置顾睾妥笱醴承堑哪退幮圆町愝^大，克林霉素耐藥率最高和最低的地區(qū)分別是我國東北地區(qū)（74.3%）和華北地區(qū)（33.6%），左氧氟沙星耐藥率最高和最低的地區(qū)是東北地區(qū)（67.7%）和華南地區(qū)（24.0%）[15]。本文中抗生素敏感度結(jié)果顯示，所有分離株對青霉素、萬古霉素和利奈唑胺完全敏感，尚未出現(xiàn)耐藥情況；對紅霉素、克林霉素和左氧氟沙星的耐藥率分別為 80.0%，74.0%和56.0%，與東北地區(qū)耐藥率相似；Ⅲ型GBS 對紅霉素（87.5%）、克林霉素（83.3%）和左氧氟沙星（54.2%）耐藥率最高，Ⅰb 和Ⅰa 型有不同程度的耐藥，V型耐藥率最低；大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥表型測試結(jié)果顯示，紅霉素抗性分離株的耐藥表型主要為cMLS型（85.0%）且好發(fā)生于Ⅲ型GBS。

攜帶耐藥基因是菌株耐藥性的常見原因[16]，GBS 對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機制有兩種：一是由erm 基因編碼的核糖體甲基化修飾介導的耐藥；二是通過mef 基因編碼的膜蛋白充當外排泵引起的耐藥。氟喹諾酮類抗生素作為一種廣譜抗生素，其細菌耐藥機制有兩種：一是gyrA 基因介導的編碼DNA 解螺旋酶發(fā)生改變影響DNA 復制，二是 parC和parE 基因介導使拓撲異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)發(fā)生導致藥物結(jié)合能力的下降。通過PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，所有M 型耐藥株均攜帶mef（A/E）基因，所有iMLS 分離株均攜帶ermTR 基因，85.3%的cMLS 型耐藥株攜帶ermB和ermB+mef（A/E）基因，與MOTALLEBIRAD 等[17]研究結(jié)果一致。左氧氟沙星耐藥分離株中共檢測到4 種基因型，以gyrA+partC+ artE 三基因突變?yōu)橹鳎砻魑靼驳貐^(qū)，對左氧氟沙星抗性的GBS 菌株耐藥機制主要為DNA解螺旋酶和拓撲異構(gòu)酶的雙改變。在我國，氟喹諾酮類藥物通常不用于孕婦和新生兒GBS 感染的治療，但被廣泛用于臨床、農(nóng)業(yè)和動物飼養(yǎng)，GBS 對喹諾酮類藥物的高耐藥性可能與環(huán)境中細菌對喹諾酮類耐藥基因的高攜帶率有關(guān)[18]。因此，監(jiān)測地區(qū)耐藥菌流行情況，加強臨床抗生素的合理應用，有助于延緩微生物耐藥株的出現(xiàn)。

綜上所述，西安地區(qū)胎膜早破孕婦生殖道GBS以血清型Ⅲ型為主，對二線治療藥物有較高的耐藥率。未做體外藥物敏感性實驗前，紅霉素不應再作為替代青霉素的首選藥物。因此，GBS 血清型及抗生素耐藥性的持續(xù)監(jiān)測，對該菌感染的預防、抗生素的合理應用及相關(guān)疫苗的開發(fā)提供科學依據(jù)。