張文娟，郭 逸，段 勇，馮 娜，彭 鵬，景媛媛

（陜西省血液中心，西安 710061）

近年來，臨床治療開始大量選擇成分輸血，機采血小板因純度高、臨床療效好、起效快等優(yōu)點導致需求量越來越大，但其可用性和安全性受到血小板儲存損傷（platelet sterage lesion,PSL）和細菌污染風險的限制[1]。PSL 是從采血到輸血過程中發(fā)生在血小板中的生化和功能變化的總和[2-4]。對PSL深入的研究可以延長血小板的體外保存期，提高使用率和減少浪費。目前PSL 診斷主要依賴于對血小板形態(tài)、功能、代謝等方面的檢測，尋找敏感度較高的生物學標志物來評價PSL 迫在眉睫。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是一種轉錄產物（＞200 個核苷酸長），盡管缺乏編碼蛋白的功能，但LncRNA 通過多級調節(jié)途徑調節(jié)基因表達，其可以在各種主要細胞功能（例如增殖、遷移和凋亡）中作為正相或者負相調節(jié)劑[5-8]。有研究表明，lncRNA 可以作為miRNA 海綿發(fā)揮作用進而調節(jié)疾病進程[9]。LncRNA 作為研究血小板的新興關注點，與miRNA 相比，其在PSL 中的研究鮮有報道。

為了深入分析血小板儲存過程中LncRNA 的表達與PSL 之間的關系，通過前期預實驗，收集陜西省血液中心4 份正常機采血小板，利用Primerpremier 6.0 軟件設計了多個LncRNAs（SENCR，SNHG9，LIPCAR，GAS5，H19，MIAT，LincRNA-p21，MEG3，UCA1 及MALAT1）引物，采用實時熒光定量RCR（real-time quantitative PCR,qRT-PCR）檢測機采血小板中上述指標的表達水平，發(fā)現(xiàn)預測心臟重塑造的基因長鏈非編碼RNA（long intergenic noncoding RNA predicting cardias remodeling,LIPCAR）的表達量變化對血小板儲存時間延長比較敏感。本研究通過擴大樣本量運用qRT-PCR 檢測機采血小板在22±2℃恒溫振蕩保存箱內伴隨儲存時間延長，LIPCAR 的表達水平變化，分析LIPCAR對PSL 的影響和意義，為其將來在血小板領域的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集本站2021年11月～2022年7月健康獻血者32 例，其中男性22 例，女性10 例，血型分別是11 例A Rh+，2 例B Rh+，2 例AB Rh+和17 例O Rh+，要求其在捐獻機采血小板前7 天內不能服用抗生素或改變血小板功能的藥物。所有樣本經檢驗科乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病毒酶聯(lián)免疫吸附試驗及核酸檢測結果均陰性，生化指標檢測結果正常，符合臨床病人輸血相關檢測要求?？蒲杏贸煞盅ㄟ^西安市中心血站倫理委員會批準，獻血者符合中華人民共和國衛(wèi)生部規(guī)定的《獻血者健康檢查要求》（GB18467-2011）標準，采集后機采血小板樣本pH 值檢測結果（7.0±0.1），血小板計數(shù)、白細胞殘余量計數(shù)、紅細胞殘留量計數(shù)合格，厭氧菌和需氧菌培養(yǎng)結果均為陰性，無細菌生長。質量檢測結果均符合《全血及成分血質量要求》（GB18469-2012）的標準。

1.2 儀器與試劑 Trima accel 全自動血液成分分離機及配套管路（80300，泰爾茂比司特有限公司）；血小板恒溫震蕩保存箱（XHZ-IB DLP90，蘇州醫(yī)用儀器廠）；無菌接管機（TSCD-2，日本TERUMO 公司）；全自動血細胞計數(shù)儀（SYSMEXKX-21，日本希森美康公司）；殘余白細胞計數(shù)儀（ADAM-rWBC，韓國納諾恩泰）；血全自動細菌培養(yǎng)系統(tǒng)（BACTECFX 2000，美國BD 公司）；熒光定量PCR 儀（7500，美國ABI 公司）；超微量核酸檢測儀（美國賽默飛公司）；逆轉錄試劑盒（貨號AG11706，中國艾科瑞生物公司）；熒光定量PCR 試劑盒（貨號AG11706，中國艾科瑞生物公司）；引物序列：β-actin 上游引物：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGC-3’；LIPCAR 上游引物：5’-TAAAGGATGCGTAGGGA TGG-3’，下游引物：5’-TTCATGATCACGCCCTCA TA-3’，PCR 引物合成（上海生工公司）。

1.3 方法

1.3.1 機采血小板的制備：應用Trima accel 血細胞分離機分離采集，全自動血細胞收集系統(tǒng)回路管組收集機采血小板，每單位血小板濃度標準為≥2.5×1011個，收集32 份健康機采血小板各100ml，置于20～24℃血小板恒溫振蕩保存箱內水平振蕩保存。

1.3.2 機采血小板的分組：將收集的每人份機采血小板通過無菌接管機分成5 份，每份約20ml，保存于22±2℃恒溫振蕩保存箱內，于不同儲存時間（1，3，5，7 和9 天）取出一份檢測血小板質量指標，用qRT-PCR 對不同儲存時間血小板中LIPCAR的表達水平進行檢測。

1.3.3 LncRNA LIPCAR 表達水平檢測：①血小板分離：將不同儲存時間的血小板樣本10 ml 倒入離心管，8000g 離心2 min，棄上清；向每5×106個細胞中加入1 ml 的RNAiso Plus，混勻，室溫（15～30℃）靜置5 min，分離RNA。②血小板RNA 提取：使用RNAiso Plus 提取血小板RNA，加入適量RNase-free 水溶解沉淀RNA。③使用反轉錄試劑盒進行操作，反應條件為37℃ 15 min，85℃ 5s，4℃。④Real Time PCR：按兩步法PCR擴增標準程序Stage 1：預變性，Reps：1，95℃ 30 s；Stage 2：PCR 反應，Reps：40，95℃ 5 s，60℃30～34 s。倍數(shù)變化被標準化為β-actin，并使用2-ΔΔCt方法計算表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，不同儲存時間LIPCAR 表達差異分析采用Kruskal Wallis 秩和檢驗，不同天數(shù)之間數(shù)據(jù)比較均采用兩兩多重比較的Bonferroni 矯正法計算矯正P值（Adj P），AdjP＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。針對LIPCAR 表達量與性別的關聯(lián)性采用t檢驗，與血型關聯(lián)性選用ANOVA 方差齊性分析，不同血型之間兩兩組間比較選用LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR 檢測LIPCAR 在正常機采血小板不同儲存時間表達量 對同一捐獻者機采血小板樣本，于儲存的第1，3，5，7，9 天進行qRT-PCR檢測LIPCAR 表達量，發(fā)現(xiàn)伴隨儲存時間延長，LIPCAR 表達水平逐漸增高，數(shù)據(jù)總體差異存在統(tǒng)計意義（H=89.46，P＜0.001）。對不同儲存天數(shù)之間LIPCAR 表達量進行兩兩多重比較，發(fā)現(xiàn)第1天與第3 天校正后的LIPCAR 表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.094）；第1 天和第5 天，第1天和第7 天，第1 天和第9 天校正后的LIPCAR 表達量比較，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）；第3 天和第7 天，第3 天和第9 天校正后的LIPCAR 表達量比較，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）；第5 天和第9 天校正后的LIPCAR 表達量比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.016），見圖1。

圖1 機采血小板樣本不同儲存時間（1，3，5，7，9d）LIPCAR 表達量qRT-PCR 檢測結果（**P＜0.05）

2.2 機采血小板捐獻者性別和血型差異與LIPCAR表達量關系 32 份機采血小板捐獻者不同儲存時間LIPCAR 表達量根據(jù)性別進行t檢驗分析，發(fā)現(xiàn)在第5 天和第1 天（t=2.189，P=0.038）、第7 天和第1 天（t=2.320，P=0.028）、第9 天和第1 天（t=2.264，P=0.032）男性表達量均高于女性，差異具有統(tǒng)計學意義，見圖2A。根據(jù)血型不同進行ANOVA 方差齊性分析，總體存在同質性差異（F=3.160，P=0.043），差異具有統(tǒng)計學意義。進一步通過LSD 法進行兩兩組間比較，發(fā)現(xiàn)AB Rh+型與O Rh+型儲存第7 天和第1 天LIPCAR 的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P=0.015），見圖2B。

圖2 機采血小板捐獻者在不同儲存時間LIPCAR 表達量與性別和血型的相關性分析

3 討論

血液中，血小板是最小的無核細胞，其易變形、高度敏感，易進入小血管，可快速應激，在出血與止血、血栓形成、損傷反應和免疫調節(jié)等過程中發(fā)揮至關重要的作用[10]。血小板結構復雜，有細胞器、線粒體、致密小體、殘核以及散在分布的顆粒成分。每個血小板均攜帶大量的核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）生物信息，通過快速、有效的應答來發(fā)揮作用。血小板中的線粒體與細胞核一樣，具有DNA，雙層細胞膜、細胞分裂周期等特點，在能量產生和代謝中發(fā)揮著重要作用。健康血小板通常包含5～8 個線粒體，其更新周期為9～24 天，而無核細胞血小板的平均存活時間為7～10 天，可能是由線粒體的更新周期決定的[11]。有研究證實B 淋巴細胞瘤-XL 可通過調節(jié)線粒體凋亡來決定血小板的存活時間[12]。LIPCAR 是線粒體長鏈非編碼RNA，提示LIPCAR 是否可能參與調控血小板的線粒體通路。

LIPCAR 在心血管疾病發(fā)生發(fā)展、預后等方面的研究已比較深入。有研究證明LIPCAR 的過表達有可能是治療動脈粥樣硬化的潛在治療靶標[13]。LIPCAR 可以預測心血管疾病患者的生存期，血漿中LIPCAR 的過表達可能是診斷ST 段抬高型心肌梗死的警告信號[14-15]。YAN 等[16]證明LIPCAR是急性心肌梗死后患者心力衰竭的潛在標志物。WANG 等[17]證實LIPCAR 通過調節(jié)TGF-β/Smad通路調節(jié)心房纖維化，為房顫的臨床治療提供了潛在的方法。在腫瘤研究領域，LIPCAR 在肝癌患者外周血和肝癌細胞株中均高表達，其可以促進肝細胞癌的增殖、遷移和轉移，抑制腫瘤細胞凋亡[18]。

針對LncRNA 在血小板方面的研究報道，迄今僅局限于利用芯片進行表達譜分析。有學者通過對血小板濃縮液RNA 測序，共檢測到2 923 個LncRNAs，其中1 413 個LncRNAs 的表達水平變化是明顯的，42 種的水平上升，28 種的水平下降[19]。國內學者通過芯片研究發(fā)現(xiàn)有大量的LncRNAs 存在于血小板中，其表達量隨著血小板儲存時間的延長而呈現(xiàn)增高或降低不同的變化趨勢，進一步分析表明部分變化的LncRNAs 與血小板聚集、激活、內吞等生理過程密切相關，并且在PSL 中發(fā)揮作用[20]。

本研究首次用大量健康獻血者機采血小板樣本依據(jù)儲存時間不斷延長，初步判定LIPCAR 表達水平不斷增高。同時，發(fā)現(xiàn)不同性別、血型之間LIPCAR 表達量伴隨儲存時間延長具有顯著性差異。通過分析推測由于機采血小板在體外時間延長，LIPCAR 表達反應性增多，并通過調控血小板的線粒體通路來調節(jié)蛋白質合成從而影響血小板的聚集和止血功能，不同人群性別和血型差異可能因為個體免疫系統(tǒng)對外界條件變化的敏感性不同而導致血小板功能差異，這與之前研究報道的血小板儲存時間延長與免疫介導的輸血反應風險增加結論相符。

總之，本實驗使LIPCAR 在正常機采血小板方面的研究邁出第一步，為進一步探討其在PSL 中的作用及分子機制提供了一定的實驗依據(jù)。但同時，實驗也有一定的局限性，具體LIPCAR 是如何參與調控PSL 的分子機制還需進行不斷驗證，后續(xù)會繼續(xù)擴大樣本量，細化指標分類，適當結合臨床機采血小板患者輸注后相關指標變化來研究其意義。