陳鐵橋，易小明，王 云，王明明，張雨相（.湖南中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬第一醫(yī)院/湖南省直中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南株洲 4000；.岳陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南岳陽(yáng) 440）

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤[1]。DLBCL 的臨床治療以利妥昔單抗與環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿及潑尼松聯(lián)合化療方案為主，但DLBCL 是一種異質(zhì)性腫瘤，部分患者仍可發(fā)生進(jìn)展，導(dǎo)致不良預(yù)后[2]。含有IQ 基序的GTPase 激活蛋白2（IQ motif containing GTPase activating protein 2，IQGAP2）包含鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域，參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架重排及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌[4]、前列腺癌[5]等惡性腫瘤中異常表達(dá)上調(diào)，其通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42，CDC42)是Rho 家族成員，參與調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、遷移及內(nèi)吞等多種生理過(guò)程。研究表明，乳腺癌[6]、胃癌[7]等惡性腫瘤中CDC42 異常表達(dá)上調(diào)，其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞G2 期向S 期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖。目前DLBCL 中IQGAP2，CDC42 的表達(dá)及臨床意義報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)DLBCL 中IQGAP2，CDC42 的表達(dá)，探討二者的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年2月～2019年2月期間湖南省直中醫(yī)醫(yī)院診治的83 例初診DLBCL 患者為DLBCL 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 歲；②經(jīng)病理組織學(xué)檢查明確診斷為DLBCL；③臨床和隨訪(fǎng)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)自身免疫性疾病、急性感染性疾病等；②并發(fā)其它惡性腫瘤；③并發(fā)凝血功能障礙等疾病。其中男性43 例，女性40例；年齡31～80（55.19±4.24）歲；Hans 標(biāo)準(zhǔn)分型：生發(fā)中心B 細(xì)胞型（germinal center B cell like,GCB）33 例，非GCB 型50 例；Ann Arbor 臨床分期：I～Ⅱ期35 例，Ⅲ～Ⅳ期48 例；B 癥狀：有44 例，無(wú)39 例；國(guó)際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index,IPI）評(píng)分：0～2 分33 例，3～5 分50 例；伴有結(jié)外侵犯54 例；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）≥245 U/L 41 例，＜ 245 U/L 42 例。選取同期反應(yīng)性淋巴結(jié)增生（reactive lymph node hyperplasia，RHL）患者50 例為RLH 組，其中男性28 例，女性22 例；年齡29～84（53.14±4.63）歲。兩組在性別、年齡之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.220,t=1.794,均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象已簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑 石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)RM2016），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司，型號(hào)CX23），兩步法免疫組化染色試劑盒（上海塞維爾生物公司，貨號(hào)G1216）。IQGAP2，CDC42單克隆抗體（美國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab187153，ab41429），彩色預(yù)染蛋白、化學(xué)發(fā)光試劑（北京酷來(lái)博科技公司），RIPA 細(xì)胞裂解液（碧云天生物公司），GeneSens2100 凝膠成像分析系統(tǒng)（上海勤翔公司），ECLIPSE Ci-L 型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3 方法

1.3.1 治療方法：均接受6～8 個(gè)周期的R-CHOP化療方案。第一天予以利妥昔單抗（美羅華,上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)：SH0051）靜脈滴注，375 mg/m2。第二天予以環(huán)磷酰胺（山西泰盛制藥有限公司，批號(hào)：0901311）750 mg/m2＋多柔比星（廣東嶺南制藥有限公司，批號(hào)：H20063155）50 mg/m2+長(zhǎng)春新堿（遼寧衛(wèi)星制藥廠(chǎng)，批號(hào)：H20068151）1.4 mg/m2，潑尼松（華中藥業(yè)公司，批號(hào)：H42021394）100 mg/m2。第3～6 天繼續(xù)予以潑尼松100 mg/m2。三周為一周期，6～8 周期，化療結(jié)束后進(jìn)行療效評(píng)估。

1.3.2 療效評(píng)估：根據(jù)非霍奇金淋巴瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)化療療效進(jìn)行評(píng)價(jià)[8]，完全緩解（complete remission,CR）：病灶完全消失，維持時(shí)間≥4 周。CR 率為CR/總例數(shù)×100%。

1.3.3 標(biāo)本采集及IQGAP2，CDC42 蛋白檢測(cè)：標(biāo)本采集：留取DLBCL 患者淋巴瘤病理組織及反應(yīng)性淋巴結(jié)增生組織（經(jīng)組織病理學(xué)檢查明確診斷）約50mg，置于10g/dl 的福爾馬林中固定過(guò)夜。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中IQGAP2，CDC42蛋白表達(dá)。組織常規(guī)石蠟包埋切片，按照常規(guī)步驟進(jìn)行免疫組化染色。封片后鏡檢，進(jìn)行染色強(qiáng)度評(píng)分（0：無(wú)染色，1：淺黃色，2：棕褐色）和染色面積評(píng)分（0：≤25%，1：25%～50%，2：≥50%），兩者乘積＜2 分為陰性，≥2 分為陽(yáng)性。

1.3.4 免疫印跡檢測(cè)IQGAP2，CDC42 蛋白表達(dá)：取DLBCL 及RLH 組織約50mg，液氮中研磨，加入RIPA 裂解液冰上裂解30min，離心取上清。金屬浴100℃15min 蛋白變性。每孔25mg 蛋白量上樣，濃縮膠80V，30min，分離膠110V，90min。濕轉(zhuǎn)法90V 轉(zhuǎn)膜90min。5g/dl 脫脂奶封閉2h。一抗4℃孵育過(guò)夜（稀釋比均為1 ∶2 000），二抗室溫孵育1h。用化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像軟件掃描條帶灰度。以GAPDH 作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白條帶的相對(duì)灰度值，表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier 分析（Log-Rank 檢驗(yàn)）。單因素及多因素COX 回歸分析影響DLBCL 患者預(yù)后的因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組IQGAP2，CDC42 蛋白表達(dá)比較 免疫組織化學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖1。DLBCL 中IQGAP2 蛋白陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，CDC42 蛋白主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿。DLBCL組中IQGAP2，CDC42蛋白陽(yáng)性率分別為83.13%（69/83）和85.54%（71/83），高于RLH 組的8.00%（4/50）和12.00%（6/50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=57.016，69.230，均P=0.000）。免疫印跡結(jié)果見(jiàn)圖2。DLBCL組織中IQGAP2，CDC42蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.21±0.23，1.34±0.25，高于RLH 組織的0.61±0.18，0.75±0.21，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.759，14.377，均P=0.000）。

圖1 免疫組化檢測(cè)組織中IQGAP2，CDC42 蛋白表達(dá)（200×）

圖2 免疫印跡檢測(cè)組織中IQGAP2，CDC42 蛋白表達(dá)

2.2 IQGAP2，CDC42 表達(dá)與DLBCL 組患者臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。Hans 分型非GCB 型、Ann Arbor 臨床分期Ⅲ～Ⅳ期組織中IQGAP2，CDC42 蛋白陽(yáng)性率大于GCB 型，Ⅰ～Ⅱ期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 IQGAP2，CDC42 表達(dá)與DLBCL 組患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 IQGAP2，CDC42 表達(dá)與DLBCL 患者短期化療療效及預(yù)后的關(guān)系 見(jiàn)表2，圖3。本研究中，83 例DLBCL 中，CR 者47 例。IQGAP2，CDC42陽(yáng)性表達(dá)組CR 率明顯低于IQGAP2，CDC42 陰性表達(dá)組（均P＜0.05）。隨訪(fǎng)過(guò)程中，死亡31 例，失訪(fǎng)1 例。IQGAP2，CDC42 陽(yáng)性表達(dá)組三年總體生存率均明顯低于IQGAP2，CDC42 陰性表達(dá)組患者（均P＜0.05）。

表2 IQGAP2，CDC42 表達(dá)與DLBCL 患者短期化療療效及預(yù)后的關(guān)系[%（n）]

圖3 IQGAP2，CDC42 蛋白表達(dá)對(duì)DLBCL 患者預(yù)后的影響

2.5 單因素及多因素COX 回歸分析影響DLBCL預(yù)后的因素 見(jiàn)表3，4。以DLBCL 患者的生存預(yù)后為因變量（1=死亡，0=存活，t=時(shí)間），進(jìn)行單因素及多因素COX 分析，結(jié)果Ann Arbor 分期Ⅲ～Ⅳ期、IQGAP2 陽(yáng)性、CDC42 陽(yáng)性是影響DLBCL 患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 單因素COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

表4 多因素COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

3 討論

DLBCL 屬于B 細(xì)胞淋巴瘤，中老年人群多見(jiàn)，主要表現(xiàn)為快速增大的淋巴結(jié)，結(jié)外腫塊及全身癥狀，特點(diǎn)為高侵襲性、強(qiáng)異質(zhì)性，往往導(dǎo)致正常淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)的彌漫性破壞[9]。DLBCL治療以化療為主，近年來(lái)隨著新的治療方法的出現(xiàn)，很多患者得到長(zhǎng)期持續(xù)緩解，但由于DLBCL 是惡性程度較高的腫瘤，仍有30%～40%的患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、難治和腫瘤進(jìn)展[3,10]。深入研究DLBCL 的疾病機(jī)制，尋找能夠評(píng)估化療療效及預(yù)測(cè)臨床生存預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，具有重要的臨床意義。

IQGAP2 是一種GTP 酶活化蛋白，結(jié)構(gòu)上包含IQ結(jié)構(gòu)域及多聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域，參與細(xì)胞骨架重構(gòu)、胞質(zhì)分裂和惡性腫瘤等病理生理學(xué)過(guò)程[11-12]。本研究中，DLBCL 中IQGAP2 蛋白表達(dá)升高，與不良臨床病理特征有關(guān)，提示IQGAP2 參與DLBCL 的腫瘤發(fā)生發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL 中IQGAP2 mRNA 明顯升高，與本研究報(bào)道一致[13]。DLBCL中IQGAP2 的表達(dá)升高與微小RNA 的調(diào)控異常有關(guān)。研究表明，miR-10b-5p 結(jié)合IQGAP2 mRNA 的3’非編碼區(qū)，降低IQGAP2 mRNA 的穩(wěn)定性，而腫瘤發(fā)生時(shí)miR-10b-5p 顯著下調(diào)，導(dǎo)致IQGAP2 mRNA 穩(wěn)定性增加，IQGAP2 的蛋白表達(dá)上調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲[4]。此外，IQGAP2 的表達(dá)能夠調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。有學(xué)者報(bào)道，DLBCL 中IQGAP2 的表達(dá)升高能夠促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中免疫抑制細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及M2 型巨噬細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)，上調(diào)免疫抑制分子如程序性死亡因子1、程序性死亡因子配體1 的表達(dá)，引起腫瘤微環(huán)境中CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，CD8+T 分泌穿孔素及顆粒酶減少，腫瘤發(fā)生免疫逃逸[13]。尚有研究表明，IQGAP2 可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞中磷脂酰肌醇3 激酶/mTOR 通路的活化，促進(jìn)非GCB 型DLBCL 腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖，腫瘤細(xì)胞凋亡減少，促進(jìn)DLBCL 腫瘤的惡性進(jìn)展[14]。這與本研究中非GCB 型DLBCL 中IQGAP2的表達(dá)較高的結(jié)果一致。本研究中，IQGAP2 陽(yáng)性的DLBCL 患者CR 率明顯較低，表明檢測(cè)DLBCL中IQGAP2 表達(dá)有助于評(píng)估聯(lián)合化療的有效性。分析其原因，IQGAP2 表達(dá)升高能夠增加DLBCL腫瘤細(xì)胞化療治療的耐藥性，降低聯(lián)合化療治療的CR 率。KUMAR 等[15]報(bào)道，IQGAP2 能夠激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 及下游AKT 通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生及腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤對(duì)化療藥物抵抗的發(fā)生。本研究中，IQGAP2 陽(yáng)性表達(dá)DLBCL 患者生存預(yù)后較差，是影響DLBCL 不良預(yù)后的獨(dú)立因素。筆者分析，一方面是IQGAP2 陽(yáng)性表達(dá)腫瘤細(xì)胞惡性程度高，腫瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，預(yù)后較差。另一方面，IQGAP2 表達(dá)升高參與促進(jìn)化療耐藥性形成，降低化療治療效果，導(dǎo)致患者不良預(yù)后。因此，IQGAP2 可能是一種新的化療療效評(píng)估和預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物，有利于輔助臨床醫(yī)生對(duì)DLBCL 的臨床治療及預(yù)后判斷。

CDC42 是Rho 家族的一種小G 蛋白，具有GTP 酶活性，是重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子。CDC42 能夠在表皮生長(zhǎng)因子等刺激下，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白富集于細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞極化狀態(tài)的形成[16-17]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤中CDC42 表達(dá)上調(diào)，其作為一種腫瘤促進(jìn)因子，抑制細(xì)胞周期素依賴(lài)性蛋白激酶抑制因子p21，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞由G1 期向S期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤過(guò)度增殖[18]。本研究中，DLBCL中CDC42 表達(dá)明顯上調(diào)，與DLBCL 不良臨床病理特征有關(guān)，提示CDC42 的表達(dá)參與促進(jìn)DLBCL的腫瘤發(fā)生及疾病進(jìn)展。分析其機(jī)制，腫瘤的無(wú)限增殖導(dǎo)致細(xì)胞處于缺血缺氧的微環(huán)境中，引起缺氧誘導(dǎo)因子1A 表達(dá)升高，缺氧誘導(dǎo)因子1A 能夠直接進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合CDC42 基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)CDC42 基因的mRNA 及蛋白表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)移[19]。此外，CDC42 作為GTP 酶信號(hào)通路的分子開(kāi)關(guān)，能激活下游絲裂原活化的蛋白激酶、c-Jun 氨基端激酶等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞遷移及細(xì)胞增殖[16-18]。尚有研究報(bào)道，CDC42 的過(guò)度表達(dá)能夠通過(guò)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[16]。本研究中，CDC42 陽(yáng)性患者聯(lián)合化療的CR 率明顯較低，提示CDC42 的表達(dá)影響DLBCL 患者化療治療的敏感性。研究表明，化療耐藥的腫瘤細(xì)胞中CDC42 表達(dá)明顯升高，CDC42 通過(guò)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3，促進(jìn)多藥耐藥基因的表達(dá)，促進(jìn)化療藥物的排出，降低化療藥物治療的有效性，導(dǎo)致化療耐藥性形成[20]。此外，本研究中，CDC42 陽(yáng)性表達(dá)DLBCL 患者預(yù)后較差，表明CDC42 為新的評(píng)估DLBCL 患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。分析其原因，CDC42 陽(yáng)性表達(dá)的DLBCL 患者對(duì)聯(lián)合化療治療的敏感性較差，導(dǎo)致患者不良生存預(yù)后。臨床上，醫(yī)師可根據(jù)CDC42的表達(dá)，對(duì)DLBCL 臨床預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，在化療期間及時(shí)調(diào)整化療方案及化療藥物的劑量，從而提高化療治療的效果，延長(zhǎng)DLBCL 患者的生存時(shí)間。

綜上所述，DLBCL 中IQGAP2，CDC42 表達(dá)升高，兩者表達(dá)與Ann Arbor 臨床分期、Hans 分型有關(guān)，共同參與DLBCL 的腫瘤進(jìn)展。DLBCL 中IQGAP2，CDC42 陽(yáng)性表達(dá)患者聯(lián)合化療的CR 率明顯較低，是影響DLBCL 患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究也存在一定的不足，首先，本研究樣本量有限，未能對(duì)不同病理亞型患者進(jìn)行分層分析，有待今后擴(kuò)大樣本含量，進(jìn)一步研究。此外，目前IQGAP2，CDC42 在DLBCL 中的具體作用的分子機(jī)制尚不明確，兩者是否能夠成為新的潛在治療靶點(diǎn)，有待今后進(jìn)行深入的機(jī)制研究。