曲志梅，董 偉，劉艷萍（山東第一醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院，濟南 271199）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是起源于造血干細胞以病理性造血為特征的異質(zhì)性克隆性疾病，具有向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化的高風險[1]。目前MDS 發(fā)病機制尚不清楚，可能與分子遺傳學、造血微環(huán)境變化、造血干/祖細胞增殖、細胞凋亡紊亂和腫瘤抑制基因甲基化等多種因素相關(guān)[2-3]。傳統(tǒng)化療對MDS 療效有限，去甲基化藥物（hypomethylating agents，HMAs）已成為對于國際預后評分系統(tǒng)（the international prognostic scoring system，IPSS）不適合移植的中危-2 級和高?；颊叩呐R床治療首選藥物[4]。HMA是一種特異性的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，包括阿扎胞苷和地西他濱（decitabine，DAC），盡管HMAs 治療的總有效率約為50%，但患者的完全緩解率僅為20%，且嚴重的骨髓抑制需要多療程鞏固治療等因素導致患者治療依從性較差[5]。此外，隨治療時間的延長，部分患者的療效會逐漸下降，耐藥性普遍存在嚴重影響HMAs 臨床效果。為進一步提高MDS 患者的緩解率和生存時間，探索與HMAs 的聯(lián)合治療是MDS 治療的主要目標。

維奈克拉（venetoclax，VCX）是2016年獲得美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）加速批準用于治療急性淋巴細胞白血病，在2019年獲得可用于治療慢性淋巴細胞白血病和淋巴瘤的高選擇性B 細胞白血病/淋巴瘤-2（B-cell leukemia/lymphoma-2,Bcl-2）抑制劑[6]。在MDS治療領(lǐng)域，多個地區(qū)的臨床研究表明，VCX 聯(lián)合HAMs 對初治高危MDS 是安全有效的[7]。一項前瞻性研究也報道，DAC 聯(lián)合VCX 維持治療對預防MDS 患者異基因造血干細胞移植治療后復發(fā)和降低化療耐受性具有一定的有效性[8]。這表明DAC聯(lián)合VCX 對MDS 的治療可能具有較大應用潛力。因此本研究通過體外培養(yǎng)MDS 細胞系探討了DAC聯(lián)合VCX 對MDS 化療敏感性的影響及潛在可能機制，以期為改善MDS 的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 人MDS 細胞系SKM-1 細胞和MUTZ-1 細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），采用含10%（v/v）FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃，5%（v/v）CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；VCX 和DAC(西安楊森制藥有限公司)；CCK-8 試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Annexin V-FITC/ PI 試劑盒（美國eBioscience 公司）；JC-1 試劑盒（美國SAB 公司）；H2DCF-DA試劑盒（美國MedChemExpress 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（美國Thermo 公司）；Laemmli 上樣緩沖液（美國Bio-Rad 公司）；小鼠抗Bcl-1，cleaved Caspase-3，P62（美國Cell Signal Technology 公司）；兔抗LC3B，Bax，Beclin 1，cytochrome C 和β-actin（美國Santa Cruz 公司）；大鼠抗小鼠或山羊抗兔二抗（美國Abacm 公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；LightCycler480II 型RT-PCR 儀（瑞士Roche 公司）；800TS 型酶標儀（美國BioTek 公司）；CytoFLEX 型流式細胞儀（美國BD 公司）。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8 法檢測MDS 細胞增殖活性：取生長狀態(tài)良好的SKM-1 和MUTZ-1 細胞，按每孔3×104個細胞接種至96 孔板，用稀釋后不同濃度的VCX（0，0.1，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0 μmol/L）處理SKM-1 或MUTZ-1 細胞24h，每孔加入10 μl CCK-8 試劑，繼續(xù)孵育2h；采用酶標儀在450 nm 處測定各孔的吸光度值（A值）。將0 μmol/L 的VCX 設(shè)為0 加藥組，并設(shè)置不含細胞的培養(yǎng)液孔為空白組。計算各組細胞增殖活性，使用統(tǒng)計學軟件繪制曲線，分析VCX 對細胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。細胞增殖活性=（A加藥-A空白）/（A0加藥-A空白）×100%。IC50值即與對照組A值減少一半所需的VCX 濃度。每組每個濃度設(shè)置6 個復孔，實驗重復三次取平均值。

1.3.2 細胞處理和分組：根據(jù)上述“CCK-8 法檢測MDS 細胞增殖活性”的檢測結(jié)果，使用8 μmol/L的VCX 分別處理MUTZ-1 細胞；按細胞處理方式的不同將MUTZ-1 分為4 組：無任何藥物處理的對照組、VCX 組、DAC 組（參考文獻[9-10]方法使用5 μmol/L 的DAC 處理）和VCX+DAC 組（使用VCX 和DAC 聯(lián)合處理細胞）。將各組細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后用于后續(xù)實驗檢測。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI 法檢測MDS 細胞凋亡率：取各組待測MUTZ-1 細胞，常規(guī)胰酶消化制成細胞懸液，細胞計數(shù)后按照Annexin V-FITC/PI 試劑盒使用說明書加入Annexin V-FITC 和PI 試劑，37 ℃下避光孵育15～ 20 min，上機分析。其中Annexin V-FITC 陽性，PI 陰性為早期凋亡細胞，Annexin V-FITC 和PI 雙陽性為晚期凋亡細胞，兩者之和為總凋亡細胞。實驗重復三次取平均值。

1.3.4 JC-1 染色法檢測MDS 細胞線粒體膜電位：取各組待測MUTZ-1 細胞，胰酶消化制成細胞懸液，計數(shù)后加入JC-1 熒光染料，37℃避光孵育30 min，PBS 溶液再次洗滌后上機進行分析。JC-1 熒光染色后細胞通常發(fā)出紅色熒光，但當線粒體膜電位降低時JC-1 則變?yōu)榫G色熒光，通過計算綠色熒光比值可分析細胞的線粒體膜電位改變。實驗重復三次取平均值。

1.3.5 H2DCF-DA 熒光探針法檢測MDS 細胞中ROS含量：按前述方法收集各組細胞，800 g 離心5 min，取細胞沉淀，加入H2DCF-DA 試劑重懸細胞，37 ℃避光孵育30 min，PBS 溶液再次洗滌細胞，上機檢測各組細胞中ROS 含量。實驗重復三次取平均值。

1.3.6 Western blotting 檢測MDS 細胞中凋亡與自噬相關(guān)蛋白的表達：取各組待測MUTZ-1 細胞，用預冷RIPA 細胞裂解液和蛋白酶抑制劑在冰上提取細胞總蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度；取40 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳分離，后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，分別加入Bcl-1(1∶800)，Bax(1∶800)，cleaved Caspase-3（1∶1 000），cytochrome C（1∶1 000），LC3B（1∶1 000），Beclin 1(1∶800)，P62(1∶800)和β-actin（1∶2000）一抗，4 ℃孵育過夜，次日加入抗小鼠或抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，通過增強化學發(fā)光檢測方法對蛋白條帶進行顯影。采用Image J 軟件評估蛋白條帶的灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，通過計算目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值對目的蛋白進行半定量分析。實驗重復三次取平均值。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 和 GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VCX 對MDS 細胞增殖的影響 見表1。CCK-8 法檢測顯示，隨VCX 濃度升高，SKM-1 細胞和MUTZ-1細胞增殖活性均明顯降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性。VCX 對SKM-1 細胞的IC50值為10.14±3.26 μmol/L，對MUTZ-1 細胞的IC50值為8.09±2.73 μmol/L。選擇對VCX 更為敏感的MUTZ-1 細胞，并使用8 μmol/L 的VCX 分別處理MUTZ-1 細胞進行后續(xù)研究。

表1 不同濃度VCX 對MDS 細胞增殖活性的影響 ［（±s）%］

表1 不同濃度VCX 對MDS 細胞增殖活性的影響 ［（±s）%］

注：與空白組比較，*tSKM-1=2.139,5.286,11.268,14.391,21.589,31.308,37.912,tMUTI-1=2.844,5.854,10.474,15.336,20.351,29.909,38.076,均P＜0.05。

VCX(μmol/L)細胞空白組F 值P 值0.11.02.55.010.025.050.0 SKM-198.23±7.11 92.97±3.18 85.23±1.90* 70.52±1.58* 62.84±2.07* 45.14±1.08* 21.24±0.58* 5.00±0.09* 17.29223.770 MUTZ-1101.05±6.92 94.00±2.43 86.54±3.21* 75.09±2.39* 63.04±1.18* 50.61±1.27* 26.92±0.94* 6.18±0.15*0.0030.001

2.2 各組MDS 細胞凋亡率與凋亡相關(guān)蛋白表達 見表2。Annexin V-FITC/PI 實驗檢測表明，與對照組比較，VCX 組、DAC 組和VCX+DAC 組細胞凋亡率明顯升高（t=3.604,3.086,5.259,均P＜0.05）；與DAC 組比較，VCX 組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（t=0.518,P＞0.05），VCX+DAC 組凋亡率則明顯升高（t=2.473,P＜0.05）。Western blotting實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，VCX 組，DAC 組和VCX+DAC 組細胞中促凋亡蛋白cytochrome C，cleaved Caspase-3 表達水平均明顯升高（t=11.637,10.755,39.319; 13.023,8.864,30.314,均P＜0.05），Bcl-2/Bax 比值明顯降低（t=14.893,13.352,22.596,均P＜0.05）；與DAC 組比較，VCX 組細胞中cytochrome C，cleaved Caspase-3 表達和Bcl-2/Bax比值差異均無統(tǒng)計學意義（t=0.882,4.159,1.541,均P＞0.05）；而VCX+DAC 組細胞中cytochrome C，cleaved Caspase-3 表達水平均明顯升高（t=28.564,17.291,均P＜0.05），Bcl-2/Bax 比值則明顯降低（t=9.244,P＜0.05）。

表2 各組MDS 細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的表達（±s）

表2 各組MDS 細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的表達（±s）

項 目對照組VCX 組DAC 組VCX+DAC 組F 值P 值凋亡率(%)4.28±1.6613.75±3.0212.39±4.1618.10±3.5045.7820.014 Bcl-2/Bax1.01±0.040.43±0.050.49±0.070.13±0.01248.0350.047 cleaved Caspase-31.04±0.022.23±0.101.85±0.063.81±0.19282.0690.022 cytochrome C1.01±0.021.67±0.051.62±0.083.24±0.10116.3840.025

2.3 各組MDS 細胞線粒體膜電位與細胞中ROS 表達 見表3。JC-1 法檢測顯示，與對照組比較，VCX 組，DAC 組和VCX+DAC 組細胞線粒體膜電位均明顯降低（t=4.269,4.089,8.710,均P＜0.05）；與DAC 組比較，VCX 組細胞線粒體膜電位雖有降低，但差異無統(tǒng)計學意義（t=0.179,P＞0.05），而VCX+DAC 組細胞的線粒體膜電位明顯降低（t=4.621,P＜0.05）。H2DCF-DA 熒光探針法檢測結(jié)果表明，與對照組比較，VCX 組、DAC 組和VCX+DAC 組細胞中ROS 含量明顯升高（t=3.686,3.109,12.428,均P＜0.05）；與DAC組比較，VCX 組細胞中ROS 含量的差異無統(tǒng)計學意義（t=0.577,P＞0.05），而VCX+DAC 組細胞中ROS 含量明顯升高t=9.319,P＜0.05）。

表3 各組MDS 細胞線粒體膜電位和細胞中ROS 含量［（±s）%］

表3 各組MDS 細胞線粒體膜電位和細胞中ROS 含量［（±s）%］

項 目對照組VCX 組DAC 組VCX+DAC 組F 值P 值JC-1 染色2.05±0.348.72±1.26*8.44±2.13*15.66±2.90*#66.7820.041 ROS 含量8.78±1.3714.02±1.45*13.20±2.41*26.45±1.53*#69.0710.046

2.4 各組MDS 細胞自噬相關(guān)蛋白表達 見表4。Western blotting 檢測顯示，與對照組比較，VCX組、DAC 組和VCX+DAC 組細胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1 表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，而P62 蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意 義（t=4.481,4.874,20.988; 9.818,8.886,15.907;4.696,4.905,9.183,均P＜0.05）；與DAC 組比較，VCX 組細胞中Beclin1，P62 蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差異均無統(tǒng)計學意義（t=0.393,0.932,0.209,均P＞0.05），而VCX+DAC 組細胞中Beclin1 表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，P62 蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.115,7.021,4.278,均P＜0.05）。

表4 各組MDS 細胞的自噬相關(guān)蛋白的表達（±s）

表4 各組MDS 細胞的自噬相關(guān)蛋白的表達（±s）

項 目對照組VCX 組DAC 組VCX+DAC 組F 值P 值Beclin11.05±0.041.62±0.151.67±0.173.72±0.21118.2570.017 P621.01±0.070.56±0.150.54±0.140.13±0.09236.920.007 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.02±0.082.60±0.192.45±0.203.58±0.27209.4220.009

3 討論

Bcl-2 家族蛋白作為一類膜整合蛋白，能夠通過調(diào)節(jié)細胞的完整性和凋亡因子的釋放來調(diào)控細胞的存亡[11]。研究表明，Bcl-2 家族抗凋亡蛋白的過度表達與血液系統(tǒng)惡性疾病發(fā)生和耐藥性的形成密切相關(guān)，而VCX 是一種高效、選擇性的Bcl-2 抑制劑，其能與Bcl-2 直接結(jié)合，改變線粒體外膜的通透性，活化凋亡相關(guān)蛋白，誘導腫瘤細胞凋亡[6]。目前，VCX 在我國主要與HAMs 類藥物聯(lián)合應用于治療高齡難治性急性髓系白血病患者[12]。然而臨床研究發(fā)現(xiàn)，VCX 聯(lián)合HAMs 對MDS 治療同樣有效[7-8]。因而本研究通過體外細胞培養(yǎng)實驗，驗證了應用VCX 對MDS 細胞DAC 化療敏感性的影響及機制。

研究表明，Bcl-2在MDS高危組中表達水平明顯高于低危組，且在急性粒細胞白血病中表達水平最高，推測應與Bcl-2 蛋白在不成熟造血細胞中堆積相關(guān)，增加MDS 向惡性髓系白血病轉(zhuǎn)化的風險[11]。而本研究表明，VCX 對MDS 細胞生長具有濃度依賴性抑制能力，可能與Bcl-2 在MDS 中的過度表達相關(guān)。為明確VCX 與DAC 的應用對MDS 細胞的凋亡作用，本實驗探究發(fā)現(xiàn)，VCX 與DAC 聯(lián)合應用明顯提高MDS 細胞的凋亡率，增加細胞中凋亡相關(guān)蛋白cytochrome C，cleaved Caspase-3的表達，下調(diào)Bcl-2/Bax 比值。眾所周知，線粒體損傷被認為是化療敏感性機制中的一個重要因素，線粒體膜電位的喪失會增加線粒體膜通透性，調(diào)節(jié)線粒體依賴的細胞凋亡途徑[13]。Bax 作為Bcl-2 家族中的重要蛋白，主要通過與Bcl-2 形成異二聚體促進線粒體外膜的通透性，發(fā)揮促凋亡作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2/Bax 比值可直接決定細胞是否走向凋亡[15]。此外，DAC 還可直接通過引起線粒體跨膜電位的丟失，進而激活線粒體凋亡途徑[15]。本研究通過檢測細胞線粒體膜電位來觀察線粒體損傷程度，結(jié)果表明，VCX 與DAC 共處理組細胞線粒體膜電位喪失較兩藥物單獨處理組明顯增高。

ROS 的產(chǎn)生和積累可導致線粒體損傷和細胞凋亡[16]。包括HMAS 在內(nèi)的多種化療藥物在誘導ROS 產(chǎn)生的過程中會激活抗氧化通路，誘導抗氧化酶的生成，中和ROS，削弱化療藥物對腫瘤細胞的殺傷。但有數(shù)據(jù)表明，聯(lián)合應用VCX 與DAC 可減少抗氧化酶的產(chǎn)生[17]。本實驗結(jié)果同樣顯示VCX與DAC 共處理組ROS 產(chǎn)生明顯增多。此外，氧化應激也被認為是化療藥物介導細胞自噬相關(guān)死亡的關(guān)鍵途徑[18]。研究報道，自噬途徑的關(guān)鍵啟動因子Beclin1 具有Bcl-2 同源結(jié)構(gòu)域BH3。Bcl-2 蛋白與Beclin1 的BH3 結(jié)構(gòu)域的相互作用，阻止了自噬體結(jié)構(gòu)的組裝，導致細胞的自噬進程被抑制[19]。微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(LC3)是自噬發(fā)生的常用指標，自噬過程中，胞質(zhì)可溶形式的LC3-Ⅰ與親脂性磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)換為自噬囊泡相關(guān)形式的LC3-Ⅱ。而P62 是LC3 的選擇性底物之一，P62 直接與LC3 結(jié)合，促進泛素化蛋白聚集物降解。由于自噬被激活時，LC3-II 積累，而P62 減少，因此LC3-II/LC3-Ⅰ和P62 常被用作研究自噬的標準標志物[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VCX 與DAC 共處理組細胞自噬水平、Beclin1 蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，P62 蛋白則顯著降低。這提示VCX 與MDS 的聯(lián)合可能通過上調(diào)MDS 細胞的自噬水平參與細胞的凋亡。然本研究是基于體外細胞實驗進行探究分析，VCX 增強MDS 對DAC 化療敏感性的機制還需通過裸鼠成瘤體內(nèi)實驗進一步研究分析。

綜上所述，VCX 可能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡、自噬和氧化應激來促進MDS 細胞對DAC 的化療敏感性。VCX 與MDS 的聯(lián)合使用可能成為有效的MDS 治療策略的潛在候選方案，值得臨床進一步探究。