李斯琴，王 興，阿日奔吉日嘎拉（巴彥淖爾市醫(yī)院.神經內科；.脊柱外科，內蒙古巴彥淖爾 015000）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是老年人常見的神經退行性疾病之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，然而該病的發(fā)生受到社會因素、藥物因素、患者因素等多種因素的影響，導致其病因及發(fā)病機制至今尚未明確[1-2]。既往研究顯示，線粒體功能障礙是導致神經系統(tǒng)中細胞凋亡的主要原因，也被認為是引起PD 患者體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）累積的主要原因之一，在PD 發(fā)病過程中起著重要作用[3]。因此，尋找調節(jié)神經元細胞線粒體功能的生物學標志物，并深入探討其分子機制，對于治療PD 疾病具有重要的臨床意義。沉默調節(jié)蛋白1（SIRT1）是一種具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的蛋白去乙?；?，可以調節(jié)細胞壽命、能量代謝及神經保護等[4]。有研究報道，SIRT1 激活劑通過激活SIRT1 依賴性PGC-1α/NRF1/TFAM 信號通路，來改善線粒體生物合成受損功能，從而預防神經發(fā)育性疾病[5]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）不僅可作為遺傳信息中間載體的輔助性角色，而且更多地承擔了各種調控功能，已被證實在腦發(fā)育、阿爾茨海默癥及PD 疾病中發(fā)揮重要調節(jié)作用[6]。JHDM1D反義RNA 1(JHDM1D antisense RNA 1，JHDM1DAS1) 是一種新發(fā)現(xiàn)的 Lnc RNA，定位于染色體7q34，有研究報道，JHDM1D-AS1 在神經發(fā)育、細胞分化、氧化應激等多個生物學過程中起關鍵作用[7]。本研究通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，SIRT1可能是JHDM1D-AS1 的靶基因，那么，JHDM1DAS1 是否能通過調控SIRT1 在PD 細胞模型中發(fā)揮潛在作用呢？故本研究利用多巴胺能神經毒素1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）處理 SH-SY5Y 細胞構建PD 模型，并檢測JHDM1D-AS1 差異表達對PD 模型細胞凋亡及線粒體功能的影響，從而深入探討JHDM1D-AS1/SIRT1 軸在PD 進展過程中的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y 購自中國科學院細胞庫，進行復蘇、傳代培養(yǎng)后，用于后續(xù)實驗。

1.2 儀器與試劑 DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）（美國Sigma 公司）；LJHDM1D-AS1 mimic，JHDM1DAS1 siRNA 序列構建和RT-PCR 引物由上海生工生物工程有限公司設計合成；AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒（美國BD 公司）；ROS 試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司）；雙熒光素酶基因檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；兔源SIRT1，鼠源β-actin 抗體及HRP 標記羊抗兔（鼠）II 抗（美國Abcam 公司）；PCR 儀（德國Biometra）；細胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；低溫高速離心機（美國Thermo 公司）；流式細胞分析儀（美國BD 公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)：采用含10g/dl 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，加入100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素，37 ℃，5ml/dl CO2孵育箱中培養(yǎng)，當細胞融合度為80%時，胰蛋白酶消化傳代，待細胞長至取對數(shù)生長期后進行后續(xù)實驗。

1.3.2 PD 模型構建及細胞轉染：取對數(shù)生長期SH-SY5Y 細胞接種于6 孔板，在其培養(yǎng)液中加入MPP+試劑（終濃度為5 mmol/L），輕輕搖晃混合均勻，恒溫孵育24 h，構建PD 模型；將正常培養(yǎng)的細胞設為對照組（control 組）。將MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞重新接種于6 孔板中，待細胞貼壁時將JHDM1D-AS1 mimic 和JHDM1D-AS1 siRNA序列轉染至SH-SY5Y 細胞中，分別記為JHDM1DAS1 mimic 組和JHDM1D-AS1 siRNA 組，培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞檢測轉染效率。

1.3.3 CCK-8 法檢測細胞活力：取對數(shù)生長期SHSY5Y 細胞，胰酶消化、重懸，接種于96 孔板，每孔5×103個細胞，37 ℃，5ml/dl CO2孵育箱培養(yǎng)24 h，加入MPP+處理24 h，每組設3 個重復孔，后分別培養(yǎng)1～5 天，吸出培養(yǎng)液，每孔分別加入CCK-8液繼續(xù)孵育2 h，在450 nm 處測量各組吸光度值。

1.3.4 RT-PCR 檢測轉染效率：利用RNA 提取試劑盒提取各組SH-SY5Y 細胞總RNA，采用反轉錄試劑盒合成cDNA，反轉錄條件為：42 ℃孵育30 min，85 ℃滅活5 min。以反轉錄合成的cDNA作為模板，進行PCR 擴增，擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，60 ℃ 30s，72 ℃ 45s，40 個循環(huán)。擴增后的樣品經PCR 儀測定，采用2-ΔΔCt法計算各組細胞中JHDM1D-AS1 相對表達量，以β-actin為內參，引物序列為：JHDM1D-AS1 上游引物：5’-TGTTGTTCTGTCACCCACCC-3’，下游引物：5’-TGCATGGGTCTTTCCACTCC-3’；β-actin 上游引物：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，下游引物：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。

1.3.5 細胞凋亡水平檢測：取轉染后各組SH-SY5Y細胞，PBS 洗滌2 次后，離心，重懸，每組加入3μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 μl，后再加入3μl PI 染液，室溫避光孵育15 min，離心去上清，每管加入200 μl 1×Bingding buffer，混勻后在1h內行流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.6 線粒體膜電位變化：取轉染后各組SHSY5Y 細胞，重懸，分別加入JC-1 熒光染料，濃度為 1 μg/ml，37 ℃孵育30 min，離心，收集底部細胞，加入1 ml PBS 緩沖液輕輕漂洗，同等條件下離心后收集細胞，加入提前預熱的500 μl PBS 緩沖液，輕輕彈起細胞使其混合均勻，經流式細胞儀檢測。

1.3.7 ROS 含量測定：收集轉染后SH-SY5Y 細胞懸液，加入200 μl 濃度為5 μmol/L 的 Cell Rox Red 熒光染料，輕搖混勻，37 ℃避光孵育30 min，離心去上清，加入1 ml PBS 緩沖液輕輕漂洗后，再次離心去上清，加入300 μl PBS 緩沖液，輕搖混勻后通過流式細胞儀進行檢測。

1.3.8 Western blot 檢測SIRT1 蛋白表達情況：取轉染后SH-SY5Y 細胞，胰蛋白酶消化，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取蛋白樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳，后轉PVDF膜，脫脂牛奶封閉1 h，加入SIRT1 和β-actin 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，次日加入IgG-HRP二抗，室溫孵育1 h，PBS 漂洗3 次，加入ECL 發(fā)光液，暗室曝光并拍照，采用Image-J 軟件分析SIRT1 蛋白相對表達。

1.3.9 雙熒光素酶基因報告實驗：分別構建含有野生型和突變型 SIRT1 基因的熒光素酶報告基因質粒，將其與JHDM1D-AS1 mimic 及control 共轉染于SH-SY5Y 細胞中，37℃孵育48 h 后，利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光強度。

1.3.10 SIRT1 激活劑處理后SH-SY5Y 細胞線粒體膜電位變化：為進一步證實JHDM1D-AS1 通過靶向作用SIRT1 調控PD 細胞線粒體功能，研究在上述轉染了JHDM1D-AS1 mimic 的細胞中加入了SIRT1激活劑Resveratrol 溶液，恒溫孵育24 h，后通過流式細胞儀分析SH-SY5Y 細胞線粒體膜電位變化。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 23.0 軟件進行結果分析，所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MPP+對SH SY5Y 細胞活力的影響 見圖1。研究采用MPP+處理SH-SY5Y 細胞構建PD模型，經CCK-8 檢測顯示，MPP+處理后1,2,3,4,5 天時SH-SY5Y 細胞活力分別為1.00±0.01,0.89±0.04,0.77±0.03,0.54±0.02,0.33±0.02，隨著培養(yǎng)時間延長細胞活力逐漸降低（均P＜0.05）。

圖1 MPP+處理對SH-SY5Y 細胞活力的影響

2.2 JHDM1D-AS1 在各組細胞中的表達 RT-PCR結果顯示，control 組SH-SY5Y 細胞中JHDM1DAS1 相對表達水平為0.85±0.21，MPP+組細胞中JHDM1D-AS1 相對表達水平為1.25±0.33，較control 組增加，差異有統(tǒng)計學意義（t=62.017，P＜0.05）。轉染JHDM1D-AS1 mimic 和JHDM1DAS1 siRNA 序列后，兩組細胞中JHDM1D-AS1相對表達水平分別為1.63±0.38 和0.72±0.17，與MPP+組相比，三組間差異亦有統(tǒng)計學意義（F=112.035，P＜0.05），說明轉染成功。

2.3 JHDM1D AS1 對MPP+誘導的SH SY5Y 細胞凋亡的影響 細胞凋亡結果顯示，MPP+組SHSY5Y 細胞凋亡率為17.64%，轉染JHDM1D-AS1 mimic 和JHDM1D-AS1 siRNA 序列后，SH-SY5Y細胞凋亡率分別為25.92%和10.74%，三組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=49.052，P＜0.05），說明JHDM1D-AS1 過表達可促進MPP+ 誘導的SHSY5Y 細胞凋亡，沉默JHDM1D-AS1 表達則結果相反。

2.4 JHDM1D AS1 調控MPP+誘導的SH SY5Y 細胞膜電位變化 見圖2。根據(jù)JC-1 染料依賴膜電位的極性發(fā)現(xiàn)，JHDM1D-AS1 過表達時，JC-1 以單體形式被釋放到胞質內，綠色熒光增強，線粒體膜電位降低；沉默JHDM1D-AS1 表達時，紅色熒光增強，線粒體膜電位升高，三組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=57.390，P＜0.05）。

圖2 JHDM1D-AS1 差異表達對MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞線粒體膜電位的影響

2.5 JHDM1D AS1 對MPP+誘導的SH SY5Y 細胞中ROS 含量的影響 流式結果顯示，MPP+組ROS相對熒光強度為27.58%±4.25%，轉染JHDM1DAS1 mimic 后，SH-SY5Y 細胞中ROS 含量顯著增加，其相對熒光強度為45.10%±6.05%；轉染JHDM1D-AS1 siRNA 后，SH-SY5Y 細胞中ROS 含量顯著減少，其相對熒光強度為14.82%±3.70%，三組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=25.794，P＜0.05）。

2.6 JHDM1D AS1 與SIRT1 之間的靶向關系 Target Scan 軟件預測顯示，JHDM1D-AS1 與SIRT1 序列具有靶向結合位點，見圖3。雙熒光素酶報告基因顯示，JHDM1D-AS1 過表達可降低WT-SIRT1 熒光素酶活性，而對MUT-SIRT1 熒光素酶活性無顯著影響，進一步說明JHDM1D-AS1 與SIRT1 之間為負向調控關系，見表1。

表1 雙熒光素酶報告基因檢測結果

圖3 JHDM1D-AS1 與SIRT1 的結合位點

2.7 JHDM1D AS1 對MPP+誘導的SH SY5Y 細胞中SIRT1 蛋白的影響 Western blot 結果顯示，Control組SIRTI 蛋白相對表達為1.00±0.23，MPP+組SIRT1 蛋白表達下調為0.70±0.27，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（t=35.740，P＜0.05）。轉染JHDM1DAS1 mimic 后，SIRT1 相對表達為0.44±0.16，較MPP+組下調；轉染JHDM1D-AS1 siRNA 后，SIRT1蛋白表達為1.34±0.22，較MPP+組上調，三組間比較差異亦有統(tǒng)計學意義（F=29.508，P＜0.05）。

2.8 JHDM1D AS1 通過SIRT1 調控SH SY5Y 細胞線粒體膜電位 為了證實MPP+誘導的PD 模型中JHDM1D-AS1 是否通過SIRT1 調控線粒體功能，研究在MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞中加入SIRT1激活劑Resveratrol后，SIRT1相對表達為1.46±0.34，較MPP+組0.70±0.27 明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.032，P＜0.05）；在轉染JHDM1D-AS1 mimic 組加入激活劑Resveratrol，SIRT1 相對表達為0.97±0.21，較僅轉染JHDM1D-AS1 mimic 組0.44±0.16 相比明顯上調，組間差異有統(tǒng)計學意義（t=3.477，P＜0.05），表明SIRT1 激活成功。進一步經流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，相比MPP+組，JHDM1D-AS1 過表達時線粒體膜電位明顯降低，SIRT1 激活時線粒體膜電位明顯升高，轉染JHDM1D-AS1 mimic 并激活 SIRT1 后，線粒體膜電位水平回升，說明JHDM1D-AS1 的確可通過靶向調控SIRT1 影響MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞線粒體功能，見圖4。

圖4 SIRT1 激活劑處理后JHDM1D-AS1 過表達對線粒體膜電位的影響

3 討論

據(jù)調查，PD 是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經退行性疾病，其發(fā)病率、致殘率較高，嚴重影響著患者的生活質量[8]。目前而言，臨床治療PD 的藥物及方法主要是緩解其癥狀，并不能阻止病情的惡化，因此，從基因水平尋找可有效干預PD 發(fā)生發(fā)展的靶向因子，是近年來醫(yī)學工作者研究的熱點及難點。有研究指出，JHDM1DAS1 是一種營養(yǎng)饑餓反應性 LncRNA，由組蛋白去甲基化酶JHDM1D 的反義鏈產生，具有抗氧化應激及神經保護作用[9]。SHI 等[10]研究數(shù)據(jù)顯示，上調JHDM1D-AS1 表達，可以抑制Bcl-2 蛋白水平和eIF2α 磷酸化水平，進而導致干細胞凋亡，提示JHDM1D-AS1 在ROS 誘導的細胞凋亡中起促進作用。LIU 等[11]研究顯示，JHDM1D-AS1 可能作為靶向miR-101-3p 的競爭性內源性RNA，結合在DUSP1 mRNA 的3’UTR 上，從而抑制神經元凋亡，發(fā)揮神經保護作用。WANG 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，JHDM1D-AS1 可以調節(jié)MPP+誘導的神經元細胞凋亡、炎癥和氧化應激，其作用機制可能是JHDM1D-AS1 通過miR-134-5p/PIK3R3 軸誘導神經元損傷，進而參與PD 的發(fā)生發(fā)展，提示JHDM1DAS1 與PD 疾病進展關系密切。

PD 最主要的病理特征是中腦黑質中多巴胺能神經元細胞選擇性丟失，誘發(fā)線粒體功能異常、氧化應激，最終導致細胞凋亡，引起神經元細胞不可逆損傷[13]。廣泛應用多巴胺能神經毒性物質建立體外PD 細胞模型是目前研究的重要手段。MPP+是多巴胺能神經元相對選擇性神經毒素，是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）的活性代謝產物，其能對中腦黑質多巴胺能神經元產生選擇性破壞作用，研究證實MPP+誘導可產生與PD 相似的神經細胞氧化應激和凋亡等病理變化，是目前制備PD細胞模型的常用誘導劑[14-15]。而神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y具有與多巴胺能神經元相似的生化特征，MPP+處理的SH-SY5Y 細胞被認為是高度模擬神經細胞線粒體功能障礙導致氧化應激的PD 細胞模型[14]。本研究中采用終濃度5 mmol/L MPP+誘導處理SH-SY5Y 細胞后發(fā)現(xiàn)細胞活力明顯降低，細胞凋亡增加，ROS 含量增加，符合PD 病理改變，表明PD 細胞模型構建成功。進一步探究發(fā)現(xiàn)，MPP+誘導PD 細胞模型中JHDM1D-AS1 表達顯著增加，轉染JHDM1D-AS1 過表達序列后，促進了MPP+誘導SH-SY5Y 細胞凋亡、ROS 含量增加及線粒體膜電位降低。線粒體膜電位的穩(wěn)定是線粒體及細胞發(fā)揮正常生理功能的基本保證，線粒體功能障礙是引起多巴胺能神經元損傷的重要機制[3]。大量研究已證實，不同刺激下細胞發(fā)生凋亡時常伴隨線粒體膜電位的下降[16]。本研究中觀察到轉染JHDM1DAS1 過表達時線粒體膜電位降低，沉默JHDM1DAS1 表達則結果相反，說明JHDM1D-AS1 可能通過誘導線粒體功能異常，引起神經元細胞損傷，在PD 疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，有望成為PD 診斷治療的潛在靶點，但其具體的作用機制還有待進一步探討。

SIRT1 是目前研究最深入的 Sirtuin 蛋白，它以組蛋白和多種非組蛋白為底物，通過其去乙?；{節(jié)自噬、凋亡、衰老、炎癥反應、氧化應激、基因轉錄等關鍵生物過程，在線粒體功能及能量代謝等多種過程中發(fā)揮關鍵作用[17-18]。CAMPOREZ等[19]研究表明，在阿爾茨海默癥動物模型中SIRT1活性降低，究其原因可能是它通過去乙?；险{PGC-1α，而后者激活線粒體生物發(fā)生。LI 等[20]研究指出，SIRT1 在PD 動物模型中表達下調，給予SIRT1 激活劑干預后，可以抑制小膠質細胞活化、減輕氧化應激和炎癥反應，避免多巴胺神經元線粒體損傷?；谏鲜鰣蟮溃茰yJHDM1DAS1 是否通過靶向作用SIRT1 而影響PD 細胞模型的線粒體功能呢？本研究通過生物學軟件預測發(fā)現(xiàn)JHDM1D-AS1 與SIRT1 存在結合位點，證實JHDM1D-AS1 可以負向調控SIRT1，說明JHDM1D-AS1 通過SIRT1 軸調節(jié)PD 模型細胞的生物學行為。其次研究通過轉染SIRT1 激活劑上調SIRT1 表達，經流式細胞儀分析，SIRT1 過表達時線粒體膜電位升高，在轉染 JHDM1D-AS1 過表達并激活 SIRT1 后，線粒體膜電位水平回升。研究結果提示，JHDM1D-AS1 過表達可以導致神經元細胞線粒體功能障礙，加速PD 疾病的發(fā)展進程，激活SIRT1 后，則可以保護線粒體功能，抑制MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡，發(fā)揮神經元細胞保護作用。此外，前期有大量文獻證實活性氧(ROS)來源于線粒體，并且通常情況下，細胞內的ROS處于較低水平狀態(tài)，若ROS 水平過高，將會對細胞和基因結構造成嚴重損傷[21-22]。本研究證實，JHDM1D-AS1 過表達后ROS 含量增加，反之沉默其表達后ROS 含量減少，與既往研究報道的ROS大量累積，可導致線粒體代謝紊亂，細胞氧化應激反應增強，最終引起細胞的凋亡，導致神經元細胞不可逆損傷的結論相一致[23]。

綜上所述，MPP+誘導的PD 細胞模型中，沉默JHDM1D-AS1 表達可以負向調控SIRT1 蛋白水平，抑制SH-SY5Y 細胞發(fā)生凋亡，減輕氧化應激反應，增加線粒體膜電位水平，保護線粒體功能，發(fā)揮了神經元細胞保護作用，在一定程度上為臨床診斷和治療PD 病提供新的思路及理論基礎。但本研究還存在一定的局限性，后期可結合體內動物實驗驗證JHDM1D-AS1 在PD 疾病形成過程中的可能作用機制。