君安醫(yī)學(xué)細(xì)胞平臺(tái)專家委員會(huì)

正常關(guān)節(jié)腔內(nèi)分泌極少量的無色透明、黏稠度極高的滑膜液，不易抽取[1]。當(dāng)關(guān)節(jié)有炎癥、損傷等病變時(shí)，滑膜液增多，稱為關(guān)節(jié)腔積液。關(guān)節(jié)疾病是臨床上的常見病和多發(fā)病，關(guān)節(jié)腔積液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)可為關(guān)節(jié)疾病診斷、鑒別診斷、療效觀察和預(yù)后評(píng)估提供有效證據(jù)，但目前國(guó)內(nèi)關(guān)節(jié)腔積液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)的水平參差不齊，檢驗(yàn)操作和結(jié)果報(bào)告尚未規(guī)范化。為進(jìn)一步推廣關(guān)節(jié)腔積液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)，使其操作及報(bào)告規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，經(jīng)國(guó)內(nèi)多位長(zhǎng)期從事該領(lǐng)域研究的君安醫(yī)學(xué)細(xì)胞平臺(tái)專家共同商討，整合國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展，制定出關(guān)節(jié)腔積液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)專家共識(shí)。

1 檢驗(yàn)?zāi)康?/h2>

通過理學(xué)檢查、細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類，準(zhǔn)確識(shí)別各類細(xì)胞及結(jié)晶種類，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌或真菌及其他有形成分，結(jié)合關(guān)節(jié)腔積液其他實(shí)驗(yàn)室檢查綜合分析，從細(xì)胞學(xué)的角度為關(guān)節(jié)疾病的診斷、鑒別診斷、治療效果和預(yù)后評(píng)估提供檢驗(yàn)診斷依據(jù)。

2 標(biāo)本采集

關(guān)節(jié)腔積液由臨床醫(yī)生穿刺獲得，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本建議至少留取1～3 ml，當(dāng)標(biāo)本量較少時(shí)，應(yīng)實(shí)施讓步檢驗(yàn)，不宜拒收。使用標(biāo)本專用管[有蓋、帶刻度、肝素鈉（25 U/ml）或EDTA 溶液抗凝，禁止使用會(huì)使黏蛋白沉淀的草酸鹽抗凝劑]，采集后加蓋，及時(shí)顛倒混勻至少6～8 次。采集后需要做唯一標(biāo)識(shí)（推薦使用條碼標(biāo)簽），至少包括患者姓名、住院號(hào)或門診號(hào)及標(biāo)本類型等信息。

3 標(biāo)本運(yùn)送與接收

3.1 標(biāo)本的運(yùn)送 標(biāo)本采集后盡快送檢，應(yīng)注意生物安全防護(hù)，避免標(biāo)本外溢。

3.2 標(biāo)本的接收 標(biāo)本由檢驗(yàn)科人員接收，仔細(xì)核對(duì)標(biāo)本信息、標(biāo)本種類、標(biāo)本留取時(shí)間、標(biāo)本容器及標(biāo)本量等是否符合要求。對(duì)于標(biāo)本量較少時(shí)，檢驗(yàn)人員應(yīng)與臨床醫(yī)生溝通。

4 標(biāo)本預(yù)處理

標(biāo)本接收后應(yīng)及時(shí)處理檢測(cè)，如果標(biāo)本中有凝塊，可用玻棒輕輕攪拌使凝塊中的細(xì)胞盡量釋放出來，此時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類結(jié)果僅供臨床參考，應(yīng)在報(bào)告單上備注說明，必要時(shí)重新采樣復(fù)查。

因關(guān)節(jié)腔積液黏稠度大，標(biāo)本計(jì)數(shù)前更需充分混勻，可置于自動(dòng)混勻器混勻5～10 min 或手動(dòng)將試管翻轉(zhuǎn)混勻至少15次以上。對(duì)于極度黏稠的標(biāo)本，推薦1ml 的關(guān)節(jié)腔積液加入約400 單位的透明質(zhì)酸酶，37℃水浴10min 降低黏稠度。

5 細(xì)胞計(jì)數(shù)

5.1 宜使用牛鮑計(jì)數(shù)板進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。

5.2 細(xì)胞過多時(shí)，標(biāo)本需進(jìn)行稀釋。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)可使用生理鹽水稀釋標(biāo)本；血性標(biāo)本有核細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，可以使用低滲鹽水溶液[0.3%(v/v)]裂解紅細(xì)胞[2-3]，不能使用冰醋酸裂解紅細(xì)胞，原因是黏蛋白遇酸會(huì)凝固。

5.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)按以下程序進(jìn)行：①吸取少量充分混勻的標(biāo)本，充入計(jì)數(shù)板兩側(cè)的計(jì)數(shù)池，靜置5～10min。②低倍鏡（10×）觀察每個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)量相差不超過10 個(gè)并均勻分布，否則應(yīng)重新充液。③在高倍鏡（40×）下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)：若初步估計(jì)9 個(gè)大方格中細(xì)胞數(shù)少于200 個(gè)，則計(jì)數(shù)9個(gè)大方格；若估計(jì)9個(gè)大方格中細(xì)胞數(shù)大于200個(gè)，則計(jì)數(shù)4 個(gè)角的大方格；若估計(jì)1 個(gè)大方格中細(xì)胞數(shù)大于200 個(gè)，則計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)4 個(gè)角和中央1 個(gè)中方格。計(jì)數(shù)壓線細(xì)胞時(shí)，應(yīng)遵循“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則[2-3]。

5.4 有核細(xì)胞計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)宜在同一計(jì)數(shù)池中完成，取兩個(gè)計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)結(jié)果的均值進(jìn)行報(bào)告[2-3]。

6 標(biāo)本離心

不黏稠或用透明質(zhì)酸酶處理過后的標(biāo)本，用相對(duì)離心力400g 離心5～10min。

7 制片

所有關(guān)節(jié)腔積液除常規(guī)細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)檢查外，均需濕片和推片進(jìn)行顯微鏡檢查。

7.1 濕片法 先滴一滴關(guān)節(jié)腔積液于玻片上，然后蓋上蓋玻片，立即觀察。

7.2 推片法 將離心后的標(biāo)本管平穩(wěn)拿出，避免晃動(dòng)或顛倒，用一次性塑料吸管緩慢吸出上清液，靠近底部沉淀時(shí)可用加樣器吸取多余上清液。將底部沉渣混勻，取大約5～20μl 標(biāo)本滴加在載玻片一端，用推片向另一端推制成約2～4cm 長(zhǎng)度的涂片，推片角度30°～45°；黏稠度較大時(shí)，適當(dāng)減小推片角度和降低推片的速度；黏稠度較小時(shí)，適當(dāng)增加推片角度和速度。對(duì)于血性標(biāo)本，離心后可吸取紅細(xì)胞層與上清液之間的“白膜”層制片。注意多份標(biāo)本制片時(shí)，推片應(yīng)避免交叉污染。

7.3 儀器法制片 細(xì)胞較少時(shí)，推薦使用細(xì)胞涂片離心機(jī)制片。此法制片細(xì)胞收集率明顯提高，分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰，利于形態(tài)辨識(shí)。

7.4 制片數(shù)量 建議每份標(biāo)本制作2～4 張涂片，用偏振光顯微鏡查找結(jié)晶時(shí)推薦厚涂片。如增加其他染色，可增加制片數(shù)量。制片結(jié)束后，貼上標(biāo)簽紙注明患者的姓名、病歷號(hào)、日期、標(biāo)本種類。

8 常用染色方法

8.1 瑞-吉染色 待涂片自然干燥后，采用瑞-吉染色，染色5～10min，根據(jù)涂片厚薄和室內(nèi)溫度酌情增減染色時(shí)間，沿著玻片的一端用流水沖掉染液，沖洗后涂片置于染色架上片尾朝上自然晾干。

8.2 其他染色 若考慮結(jié)核性關(guān)節(jié)炎需增加抗酸染色，化膿性關(guān)節(jié)炎可增加革蘭染色；懷疑脂質(zhì)物質(zhì)可用蘇丹Ⅲ或油紅O 染色鑒別；普魯士藍(lán)染色（鐵染色）用于檢測(cè)積液中的含鐵血黃素顆?；蚝F血黃素細(xì)胞[4]。

9 閱片與細(xì)胞分類

9.1 濕片直接鏡檢 觀察結(jié)晶時(shí)，光源亮度不宜調(diào)太高，應(yīng)在暗視野下觀察，如果有條件使用偏振光觀察結(jié)晶，此時(shí)應(yīng)先對(duì)照陽性質(zhì)控片[5]。并盡可能在濕片中間部分觀察鏡下的有形成分，若只在蓋玻片四周出現(xiàn)晶體則可能為偽差，所用蓋玻片必須無灰塵及劃痕，因?yàn)榛覊m可呈雙折光陽性[1]。

9.2 涂片染色鏡檢 使用普通光學(xué)顯微鏡觀察，低倍鏡瀏覽全片，觀察細(xì)胞分布，評(píng)估染色效果，查找有無體積較大的細(xì)胞或成堆細(xì)胞。再用油鏡觀察和鑒定其性質(zhì)；選擇染色滿意、細(xì)胞分布均勻的部位以“弓”字形分類100～200 個(gè)有核細(xì)胞，分類結(jié)果以百分比形式報(bào)告。注意觀察病原微生物及其他有形成分。

10 報(bào)告

推薦采用圖文報(bào)告的形式，內(nèi)容包括常規(guī)、細(xì)胞學(xué)和實(shí)驗(yàn)室報(bào)告提示三部分。

10.1 常規(guī)部分 包括顏色、透明度、黏蛋白凝塊形成試驗(yàn)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，有核細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類[3,6]。

10.2 細(xì)胞學(xué)部分 包括圖像的采集和形態(tài)學(xué)的描述，異常細(xì)胞的分級(jí)報(bào)告、提示和建議等。同時(shí)報(bào)告其他有形成分如結(jié)晶、細(xì)菌、真菌、脂肪滴及其他有價(jià)值的信息。

10.2.1 形態(tài)學(xué)描述：通過圖像采集系統(tǒng)在鏡下選擇2～4 幅有代表性的圖片進(jìn)行報(bào)告。對(duì)特殊細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)描述，包括細(xì)胞的分布、大小、胞質(zhì)量、胞質(zhì)內(nèi)容物、胞質(zhì)顏色、胞核大小、核形、核染色質(zhì)排列、核仁數(shù)量與大小等。若實(shí)驗(yàn)室條件允許，建議用偏振光顯微鏡進(jìn)行采圖及鑒定結(jié)晶。

10.2.2 異常細(xì)胞的分級(jí)報(bào)告：未查見惡性細(xì)胞、查見核異質(zhì)細(xì)胞、查見可疑惡性細(xì)胞及查見惡性細(xì)胞。

10.3 提示及建議 根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量、分類情況、形態(tài)學(xué)上的變化及其他檢出的有價(jià)值成分（如結(jié)晶、微生物等），結(jié)合患者臨床資料綜合分析，向臨床提供細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)的合理提示或建議。

11 臨床意義

11.1 細(xì)胞計(jì)數(shù) 健康人滑膜液中白細(xì)胞極少，一般小于500×106/L，關(guān)節(jié)炎癥時(shí)白細(xì)胞總數(shù)增高，急性痛風(fēng)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)細(xì)胞總數(shù)可達(dá)20 000×106/L，化膿性關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞總數(shù)常超過50 000×106/L。

11.2 細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 健康人滑膜液中單核巨噬細(xì)胞約為65%，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分別占20%和10%左右，偶見滑膜細(xì)胞和組織細(xì)胞[1,7]。各有形成分的臨床意義如下：

11.2.1 軟骨素顆粒：軟骨素顆粒也稱軟骨素結(jié)晶，健康人滑膜液中大量存在，瑞-吉染色后呈紫紅色、粗沙狀、散在分布，起到潤(rùn)滑、營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)關(guān)節(jié)的作用。軟骨素減少意味著關(guān)節(jié)液質(zhì)量變差，應(yīng)該予以重視[5,8]。

11.2.2 中性粒細(xì)胞：在非炎性積液中性粒細(xì)胞比例常低于50%，在炎癥性積液中高于50%（見圖1），常見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（中、晚期）、賴特（Reiter）綜合征、晶體性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作、強(qiáng)直性脊柱炎累及關(guān)節(jié)、銀屑病關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌、真菌感染等。典型的化膿性關(guān)節(jié)炎中性粒細(xì)胞比例常高于90%。創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、退變性關(guān)節(jié)炎、腫瘤（非感染性疾?。┑戎行粤＜?xì)胞小于30%[9]。

圖1 急性炎癥（瑞-吉染色 1 000×）

11.2.3 淋巴細(xì)胞：健康人滑膜液中僅見少量淋巴細(xì)胞，當(dāng)免疫性損傷時(shí)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥或結(jié)核性關(guān)節(jié)炎時(shí)，滑膜液中成熟淋巴細(xì)胞會(huì)增多（見圖2）。當(dāng)一些炎癥刺激時(shí)，還可伴隨胞質(zhì)變化的反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增高[8]。

圖2 免疫性損傷關(guān)節(jié)?。ㄈ?吉染色 1 000×）

11.2.4 單核巨噬細(xì)胞：增高提示慢性炎癥，可見于病毒性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等（見圖3）。

圖3 慢性炎癥（瑞-吉染色1 000×）

11.2.5 吞噬細(xì)胞：可吞噬各種物質(zhì)，吞噬紅細(xì)胞（見圖4）、含鐵血黃素顆粒、血紅素結(jié)晶可提示不同時(shí)間的陳舊性出血；吞噬脂滴提示外傷性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；吞噬細(xì)菌、真菌，提示相應(yīng)的感染性關(guān)節(jié)炎；吞噬尿酸鈉結(jié)晶提示痛風(fēng)；吞噬焦磷酸鈣結(jié)晶提示焦磷酸鈣晶體沉積病。

圖4 吞噬紅細(xì)胞提示陳舊性出血（濕片未染色 1 000×）

圖5 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（瑞-吉染色/偏振光1 000×）

圖6 焦磷酸鈣晶體沉積病（假性痛風(fēng)）（瑞-吉染色/偏振光1 000×）

11.2.6 滑膜細(xì)胞：是關(guān)節(jié)內(nèi)襯細(xì)胞，是保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的第一防線，與間皮細(xì)胞形態(tài)相似。當(dāng)成堆或成片脫落時(shí)，說明滑膜損傷嚴(yán)重，易加速關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞和功能損傷，此時(shí)也可見退化、變性的不規(guī)則滑膜細(xì)胞[8]。

11.2.7 賴特（Reiter）細(xì)胞：是指吞噬了凋亡的多核中性粒細(xì)胞的單核巨噬細(xì)胞。該細(xì)胞在防止中性粒細(xì)胞自溶方面發(fā)揮重要作用，從而防止局部組織損傷。多見于賴特綜合征（結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎、尿道炎三聯(lián)征），也可見于其他多種關(guān)節(jié)炎，不具有特異性。

11.2.8 狼瘡（LE）細(xì)胞：可見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、自身免疫性疾病、慢性活動(dòng)性肝炎、結(jié)核等，在新鮮涂片上發(fā)現(xiàn)狼瘡細(xì)胞則有助于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷[1]。此細(xì)胞應(yīng)與吞噬細(xì)胞核的中性粒細(xì)胞-塔特（tart）細(xì)胞相鑒別[10]。

11.2.9 類風(fēng)濕細(xì)胞：又稱為“包涵體細(xì)胞”，中性粒細(xì)胞吞噬了由免疫復(fù)合物、補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子、纖維蛋白等組成的包涵體，多位于胞質(zhì)周邊位置。主要出現(xiàn)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中，往往提示預(yù)后不良，但也可見于其他炎癥性關(guān)節(jié)炎。

11.2.10 嗜酸性粒細(xì)胞：可見于萊姆病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、寄生蟲感染、過敏反應(yīng)等。

11.2.11 紅細(xì)胞：常見于穿刺本身造成的出血，也可能是創(chuàng)傷、骨折、血管瘤、凝血功能障礙、色素沉著絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎、腫瘤等原因造成的陳舊性的出血。

11.2.12 多核巨細(xì)胞：可見于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、骨腫瘤等。

11.2.13 腫瘤細(xì)胞：關(guān)節(jié)腔積液中腫瘤細(xì)胞很罕見，可以是原發(fā)的，也可以來自于其他原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移，如白血病、淋巴瘤、腺癌等。

11.2.14 微生物：最常見的感染細(xì)菌主要是金黃色葡萄球菌，也可見大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、淋病奈瑟菌、結(jié)核分枝桿菌的感染。真菌感染比較罕見，主要是免疫抑制狀態(tài)、廣譜抗生素的使用或關(guān)節(jié)的直接感染。

11.2.15 結(jié)晶：普通光學(xué)顯微鏡及偏振光顯微鏡均可以查找結(jié)晶，偏振光相差顯微鏡檢出率更高，其中堿性磷酸鈣結(jié)晶通過茜素紅染色可以有一定鑒別作用[11]。關(guān)節(jié)腔積液中主要晶體及特征見表1。

表1 偏振光相差顯微鏡可見關(guān)節(jié)腔積液中主要晶體及特征

11.2.16 其他有形成分：偶見成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肥大細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血小板、漿質(zhì)體、纖維蛋白樣絲狀物等。

12 涂片保存

發(fā)出報(bào)告后，將涂片的油滴擦拭后進(jìn)行保存歸檔，保存時(shí)間根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程實(shí)施，一般保存3～5年。

13 生物安全與防護(hù)

13.1 所有標(biāo)本均應(yīng)按照傳染性標(biāo)本處置，操作人員嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防做好個(gè)人防護(hù)。

13.2 廢棄標(biāo)本按照醫(yī)療廢物處置條例相關(guān)要求執(zhí)行。

執(zhí)筆：楊清蘭，曹喻

主審：吳茅，許紹強(qiáng)，段愛軍，閆立志，梁勤，高建軍，黃道連，趙成艷

參加共識(shí)討論的專家（按姓氏拼音排序）：

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