馬盼盼,康啟超,陳雪,王興,田芯瑗,郝勝菊,惠玲,徐福蓉,張釧

Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type1,NF1,OMIM: 162200)是一種由NF1基因突變導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳病,成年先證者該病完全外顯[1]。NF1通過影響來源于胚胎神經(jīng)鞘的組織而導(dǎo)致多種臨床表現(xiàn)[2]。該病主要臨床表現(xiàn)包括牛奶咖啡斑、皮膚及皮下神經(jīng)纖維瘤、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤,其他不常見的臨床表現(xiàn)包括學(xué)習(xí)障礙和骨骼系統(tǒng)異常(如:脊柱側(cè)彎)等,并且其臨床表型隨著年齡的增加而增多和加重[3]。NF1的發(fā)病率約為1∶3 500,自發(fā)突變率為50%左右[4]。本文報(bào)告1例家族遺傳性NF1患者,通過全外顯子測(cè)序?qū)υ摶颊哌M(jìn)行基因變異分析,對(duì)可疑變異位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證,明確其致病基因變異位點(diǎn),探討其致病原因。

1 資料與方法

1.1臨床資料 先證者來自于甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心。先證者男,33歲,自述10歲左右自己發(fā)現(xiàn)皮膚上有咖啡斑,近3年來出現(xiàn)手腳麻木、無力、脖子不能扭轉(zhuǎn),不能從事體力勞動(dòng)。查體:胸前及腰間有多個(gè)牛奶咖啡斑(圖1a),身體多處發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維瘤,先證者通過脊椎手術(shù)進(jìn)行了部分神經(jīng)纖維瘤的切除,癥狀有所緩解,脖子可以轉(zhuǎn)動(dòng)。診斷:NF1。先證者父親也有多個(gè)牛奶咖啡斑,出現(xiàn)時(shí)間不詳,背部有多個(gè)神經(jīng)纖維瘤突起(圖1b)。先證者妻子未發(fā)現(xiàn)牛奶咖啡斑,先證者與妻子結(jié)婚9年未自然懷孕,輔助生殖生育雙胞胎男孩,現(xiàn)4歲,均有牛奶咖啡斑(圖1c～1d)。該患者有家族史,家系圖見圖2。

1.2標(biāo)本采集及基因組DNA提取 經(jīng)先證者及其家屬知情并簽署基因檢測(cè)知情同意書。分別抽取先證者及其家系外周靜脈血各2～3 mL,EDTA抗凝。使用天根DNA提取試劑盒提取標(biāo)本DNA,NanoDrop2000測(cè)定DNA的濃度均在50 ng/μL左右,OD260/280在1.8～2.0之間。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)([2021]GSFY倫審[65]號(hào))批準(zhǔn)。

1.3目標(biāo)序列捕獲、高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

1.3.1樣本基因組DNA片段化、末端修復(fù)及3′加“A” 利用酶切的方式將基因組DNA打斷為200 bp左右的小片段DNA,末端修復(fù)和3′加“A”。

1.3.2接頭連接及加標(biāo)簽 利用標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)建庫(kù)試劑盒對(duì)小片段DNA段進(jìn)行Adapter接頭連接,再加入Index標(biāo)簽,并通過Qubit 3.0 Fluorometer和Agilent 2100 Bioanalyzer system進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢。

1.3.3目標(biāo)區(qū)域捕獲和高通量測(cè)序 生物素特異標(biāo)記的探針與文庫(kù)DNA進(jìn)行雜交,鏈霉親和素修飾的捕獲磁珠捕獲目的基因。采用Illumina Next Seq CN500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4數(shù)據(jù)篩選與生物信息學(xué)分析 應(yīng)用分析平臺(tái)(北京邁基諾公司)進(jìn)行致病基因篩選。應(yīng)用ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)及人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Gene Mutation Database,HGMD)(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)分析該位點(diǎn)變異。

1.4Sanger驗(yàn)證 使用在線Primer 3.0(http://primer3.ut.ee)軟件設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增引物序列:F 5′-GCAACAGAGGAAGACACCAT-3′,R:5′-CACAGTTTGACACAGGCAAT-3′。對(duì)候選致病基因NF1變異位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,Sanger測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果與NF1基因參考序列(NM_000267)進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1全外顯子基因檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)分析,篩選到與先證者臨床表型相關(guān)的變異:NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點(diǎn)雜合變異,該變異位于NF1基因內(nèi)含子8上,即剪接位點(diǎn)第c.889-2_889-1位插入6個(gè)堿基TTTCTG,可能導(dǎo)致外顯子的跳躍或內(nèi)含子的滯留。

2.2Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 應(yīng)用Sanger測(cè)序?qū)ο茸C者全外顯子組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。Sanger測(cè)序結(jié)果與全外顯子組測(cè)序結(jié)果一致,先證者NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點(diǎn)雜合變異。同時(shí)對(duì)家系其他成員進(jìn)行該位點(diǎn)Sanger測(cè)序,結(jié)果提示先證者父親及其兩個(gè)雙胞胎兒子均存在NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點(diǎn)雜合變異,先證者之妻未見該位點(diǎn)變異(圖3)。

圖3 先證者家系NF1基因變異位點(diǎn)Sanger測(cè)序圖(紅色箭頭示變異位點(diǎn))

2.3致病性分析結(jié)果 根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)2015年指南[5]對(duì)該變異位點(diǎn)進(jìn)行致病性分析,c.889-2_889-1insTTTCTG變異為NF1基因剪接位點(diǎn)插入突變,該變異導(dǎo)致基因功能可能喪失,為超強(qiáng)致病證據(jù)(PVS1);在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)中該變異頻率小于0.000 5,為低頻變異,為中等致病證據(jù)(PM2);該突變相關(guān)的疾病與先證者臨床表型高度吻合,為支持證據(jù)(PP4)。因此該變異評(píng)級(jí)為致病性變異。文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)未有該位點(diǎn)的相關(guān)性報(bào)道,ClinVar及HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)均未收錄該位點(diǎn)。

3 討論

Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病是由腫瘤抑制基因(NF1基因) 突變導(dǎo)致的。NF1基因位于17q11.2,全長(zhǎng)350 kb。NF1基因的表達(dá)產(chǎn)物為神經(jīng)纖維蛋白,由2 818個(gè)氨基酸組成,有抑制腫瘤的作用[6]。HGMD已報(bào)道的NF1突變類型目前已超過3 000種,突變類型包括缺失/插入突變、錯(cuò)義突變、無義突變、剪接突變、復(fù)雜重排等,尚未發(fā)現(xiàn)明確的突變熱點(diǎn)。NF1的診斷主要依據(jù)1988年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)制定的Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。包括:①6個(gè)及以上的牛奶咖啡斑,青春期前直徑大于5 mm,青春期后直徑大于15 mm;②2個(gè)及以上任何類型的神經(jīng)纖維瘤,或1個(gè)叢狀神經(jīng)纖維瘤;③腋窩或腹股溝雀斑;④視神經(jīng)膠質(zhì)瘤;⑤2個(gè)及以上虹膜錯(cuò)構(gòu)瘤(Lisch 結(jié)節(jié));⑥骨損害,如蝶骨翼發(fā)育不良,長(zhǎng)骨皮質(zhì)細(xì)線化,有或無假關(guān)節(jié);⑦一級(jí)親屬關(guān)系中有符合上述標(biāo)準(zhǔn)的NF1。以上標(biāo)準(zhǔn)符合2條即可確診NF1[7]。

本家系中先證者臨床表型根據(jù)NF1診斷標(biāo)準(zhǔn)可以臨床診斷為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病。但是在先證者未行基因檢測(cè)的情況下,即進(jìn)行輔助生殖,導(dǎo)致出生的雙胞胎兒子也同樣為NF1患者。因此,在做人工輔助生育之前,臨床醫(yī)生應(yīng)仔細(xì)詢問患者病史并進(jìn)行相應(yīng)的體格、皮膚檢查;有臨床遺傳病家族史的夫妻做人工輔助生育之前應(yīng)該先做相關(guān)基因檢測(cè)。明確診斷后,再通過輔助生殖技術(shù)、胚胎植入前基因診斷和孕中期產(chǎn)前單基因病診斷技術(shù)來阻斷遺傳病患兒的出生。

NF1可出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn),除常見的表型之外,文獻(xiàn)報(bào)道NF1患者也有皮膚麻木、肢體麻木、乏力的表型[8],研究發(fā)現(xiàn),剪切位點(diǎn)突變常與脊髓腫瘤相關(guān)[9]。本文對(duì)先證者全外顯子進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)NF1基因8號(hào)內(nèi)含子剪接位點(diǎn)雜合性插入突變c.889-2_889-1insTTTCTG,根據(jù)ACMG指南評(píng)級(jí)為致病性變異。Sanger測(cè)序檢測(cè)到先證者、先證者父親和先證者的雙胞胎兒子均存在該位點(diǎn)雜合變異,先證者妻子未發(fā)現(xiàn)該變異。根據(jù)臨床表型、基因檢測(cè)結(jié)果和家系調(diào)查可以診斷此家系患者為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病,致病基因突變?yōu)镹F1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點(diǎn)。

剪接突變是人類遺傳病突變類型中常見的一種,其導(dǎo)致的結(jié)果有外顯子的跳躍、內(nèi)含子的滯留等。在哺乳動(dòng)物基因組中,剪接位點(diǎn)為經(jīng)典GT-AG組合的概率為98.71%[10-11]。正常情況下NF1基因c.889-5_895位點(diǎn)序列為tgtagAAGTTAT(小寫為內(nèi)含子,大寫為外顯子),發(fā)生突變后此段序列為tgtaTTTCTGgAAGTTAT(小寫為內(nèi)含子,大寫為外顯子,下劃線標(biāo)出為插入序列)。正常情況下剪接發(fā)生于c.889-2_889-1AG,9號(hào)外顯子從c.889_890AA開始編碼氨基酸。突變發(fā)生以后剪接只能發(fā)生于后面的c.890_891AG,9號(hào)外顯子從c.892_893TT開始編碼氨基酸,導(dǎo)致閱讀框移位。由于實(shí)驗(yàn)條件限制,本研究尚未對(duì)NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點(diǎn)進(jìn)行剪接影響分析,因此該突變對(duì)NF1基因mRNA剪接的影響還需進(jìn)一步的研究。

Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病的表型多種多樣,一個(gè)家系中同樣的突變會(huì)有不同的表型。雖然具體表現(xiàn)、進(jìn)展速度和并發(fā)癥的嚴(yán)重程度差別很大,但病情在個(gè)體一生中是逐漸進(jìn)展的[12]。目前沒有有效的治療方法,臨床治療通常局限于監(jiān)測(cè)和對(duì)癥治療,通常是手術(shù)治療特定的并發(fā)癥[13]。本家系中4人攜帶NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點(diǎn)突變,但是他們的臨床表型輕重不一。先證者除了有明顯的牛奶咖啡斑之外,全身多處有神經(jīng)纖維瘤,進(jìn)行手術(shù)部分切除。但是文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)纖維瘤不易徹底剔除,容易復(fù)發(fā),應(yīng)定期檢查[14]。相比較之下,先證者父親也有多處牛奶咖啡斑,背部有神經(jīng)纖維瘤狀突起,但沒有明顯的神經(jīng)癥狀?？赡苁且?yàn)樯窠?jīng)纖維瘤長(zhǎng)在不同部位影響不同部位的功能,從而表現(xiàn)出不同的表型,也有可能是常染色體顯性遺傳病所有的遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象導(dǎo)致的。先證者兩個(gè)雙胞胎兒子目前只是有牛奶咖啡斑,沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維瘤,可能是年齡尚小未表現(xiàn)出,應(yīng)定期體檢、隨訪。

總之,本研究對(duì)1例遺傳性Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病患者及其家系進(jìn)行了表型和基因型的研究。NF1基因c.889-2_889-1insTTTCTG位點(diǎn)雜合變異為該家系的致病原因,且該位點(diǎn)為未見報(bào)道的新發(fā)變異,擴(kuò)充了NF1基因突變譜,為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病患者的診斷提供了依據(jù)。對(duì)于輔助生殖的夫婦,一定要進(jìn)行詳細(xì)的病史問詢和體格檢查來判斷是否有遺傳病存在的可能,如果存在遺傳病需明確診斷后再進(jìn)行輔助生殖,通過胚胎植入前基因診斷和孕中期產(chǎn)前基因病診斷技術(shù)來阻止患兒的出生。