馬冰硯,董麗萍,陸曉云,汪生,覃詩純,汪銳,李梅,肖風(fēng)麗,

白癜風(fēng)(vitiligo)是一種常見的自身免疫性皮膚病,主要表現(xiàn)為皮膚和黏膜的色素脫失。白癜風(fēng)的病期分為進展期和穩(wěn)定期;臨床中根據(jù)白斑面積分級分為輕度(<1%體表面積),中度(1%～5%體表面積),中重度(6%～50%體表面積),重度(>50%體表面積)[1]。該病病因不明,目前研究表明其與免疫、遺傳、環(huán)境暴露等因素相關(guān)[2]。近年來,越來越多的證據(jù)表明代謝異常與包括白癜風(fēng)在內(nèi)的自身免疫性疾病相關(guān)[3-5]。

代謝組學(xué)是繼基因組、蛋白組研究最下游小分子代謝物的新興手段,常用于研究各種疾病引起的代謝特征[6]。但因白癜風(fēng)病因復(fù)雜、臨床分型較多,目前對白癜風(fēng)患者的代謝譜知之甚少。近期,靶向代謝組學(xué)報道表明,氨基酸和脂質(zhì)的代謝紊亂與白癜風(fēng)患者的生理和病理變化相關(guān)[7-8];非靶向代謝組學(xué)報道表明,非節(jié)段性白癜風(fēng)患者血漿樣本LPC、PAF、琥珀酸、CXCL4和CXCL7等多種促炎因子顯著升高[9]。為了找尋更多的差異性代謝物,本實驗擴大樣本量,選用總體靈敏度更高的血清樣本[10],利用液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)結(jié)合非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析進展期白癜風(fēng)患者與健康對照間的血清代謝組學(xué)特征,篩選出更多的差異性代謝物及代謝通路,試圖為白癜風(fēng)的診療提供新的研究方向。

1 對象與方法

1.1研究對象 于2020年10月—2021年6月期間,在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科門診招募白癜風(fēng)患者,診斷基于皮膚色素脫失斑和伍德燈(Wood燈)檢查,由兩名皮膚科醫(yī)生同時對患者進行診斷和病情評估。健康對照志愿者來自于本院體檢中心。收集資料包括性別、年齡、家族史、既往病史、病程、臨床表現(xiàn)、疾病活動性、治療等?；颊呷虢M標(biāo)準(zhǔn):①進展期白癜風(fēng)患者:根據(jù)2021版中國白癜風(fēng)診療共識,參考白癜風(fēng)疾病活動度(VIDA)評分、臨床特征、同形反應(yīng)和Wood燈四個指標(biāo),滿足其中之一即為進展期[1];②無精神類疾病及重大代謝類疾病;③近1個月無系統(tǒng)用藥史及光療史;④近1周清淡飲食。對照入組標(biāo)準(zhǔn):①無其他皮膚病;②無自身免疫疾病、精神類疾病、重大代謝類疾病;③近1個月內(nèi)無用藥史;④近1周清淡飲食;⑤白斑面積>1%。在研究對象簽署知情同意書后,抽取其空腹晨血2 mL于常規(guī)生化促凝管中,離心后-80 ℃冰箱凍存,待檢測。本研究得到安徽醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會的批準(zhǔn)(倫理審批號:PJ2022-04-25)。

1.2研究方法

1.2.1儀器與試劑 甲醇、乙腈(德國Sigma公司),Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司),Q-Exactive plus 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2.2實驗方法 取血清樣本120 μL于1.5 mL聚丙烯塑料離心管中,加入乙腈萃取,經(jīng)震蕩離心轉(zhuǎn)移上清至新管中,室溫下氮氣流吹干。100 μL復(fù)溶液復(fù)溶,渦旋混勻后經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾,濾液裝入棕色進樣小瓶中待測,在每個待測樣本中吸取等量液體混勻制作內(nèi)部質(zhì)量控制(quality control, QC)。使用梯度模式下以300 μL/min的流速提供的二元流動相進行20 min梯度洗脫實現(xiàn)色譜分離后,進行LC-MS分析。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 采用Thermo ScientificTMCompound DiscovererTM軟件處理本研究的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用SERRF構(gòu)建隨機森林模型消除誤差矯正QC后,采用主成分分析(principal component analysis, PCA)和聚類分析對白癜風(fēng)樣本和健康樣本進行差異代謝物分析。通過單因素分析確定兩組樣本間的差異倍數(shù)[Fold change, FC=AVERAGE(實驗組)/AVERAGE(對照組)],P值=TTEST(實驗組,對照組,2,2);Bonferroni矯正P值以及多元變量統(tǒng)計模型的VIP值來篩選差異代謝物,以FC>1.2或者FC<0.83,矯正P<0.05,VIP>1作為篩選差異代謝物的條件。對篩選出的差異代謝成分進行聚類分析并繪制熱圖,并利用KEGG數(shù)據(jù)庫進行代謝物代謝通路注釋。

2 結(jié)果

2.1研究對象的基本特征 如表1所示,白癜風(fēng)組及健康對照組年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)匹配,之間無顯著差異;白癜風(fēng)組均處于疾病進展期且白斑面積均>1%,病程(6.87±7.60)年。

表1 研究對象基本特征 例(%)

2.2代謝組學(xué)實驗結(jié)果穩(wěn)定性分析 經(jīng)LC-MS質(zhì)譜分析和QC矯正后,對進展期白癜風(fēng)患者和健康對照者血液樣本間的正負(fù)離子模式分別進行PCA和OPLS-DA分析,結(jié)果顯示,無監(jiān)督PCA模型下分離趨勢不明顯(圖1a～1b),經(jīng)過監(jiān)督的OPLS-DA模型顯示較好的分離效果(圖1c～1d);200次置換檢驗(permutation test)提示實驗結(jié)果穩(wěn)定,可重復(fù)性好(圖1e～1f)。

PCA in positive ion mode; PCA in negative ion mode; OPLS-DA in positive ion mode; OPLS-DA in negative ion mode; Test diagram of 200 displacements in positive ion mode; Test diagram of 200 displacements in negative ion mode

2.3進展期白癜風(fēng)組及健康對照組間差異性代謝物的篩選 經(jīng)分析,共發(fā)現(xiàn)10個差異代謝物。與對照組相比,顯著下調(diào)的差異性代謝物包括胡椒堿(piperine)和泛酸(pantothenic acid);顯著上調(diào)的物質(zhì)包括:1-硬脂?；视?1-stearoylglycerol)、硬脂酰乙醇酰胺(stearoyl ethanolamide)、咪唑乙酸(imidazo-leacetic acid)、硬脂酸(stearic acid)、二十碳五烯酸(cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid)、油酰乙醇酰胺(oleoyl ethylamide)、膽紅素(bilirubin)和尿苷(uridine)(圖2)。

圖2 10種差異性代謝物熱圖

2.4差異代謝物通路預(yù)測結(jié)果 利用Metabo Analyst 5.0平臺結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫對差異性代謝物進行分析。經(jīng)鑒定的10個差異代謝物可映射出8條代謝通路,其中不飽和脂肪酸的生物合成代謝通路在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 KEGG通路富集氣泡圖

3 討論

白癜風(fēng)是一種皮膚黑素細(xì)胞缺失而導(dǎo)致明顯白斑的自身免疫性皮膚病,色素代謝異常在該病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2,7]。代謝組學(xué)主要研究各種代謝路徑的底物和產(chǎn)物的小分子代謝物,可以作為疾病診斷和預(yù)測的生物標(biāo)志物[6]。既往研究表明,失調(diào)的脂肪酸代謝途徑可能參與白癜風(fēng)的發(fā)病機制[7-8]。為進一步探究白癜風(fēng)患者體內(nèi)代謝譜失衡特征,筆者對中度及以上進展期白癜風(fēng)患者進行血清非靶向代謝組學(xué)的分析,部分揭示了白癜風(fēng)患者的血清代謝譜特征。

本研究發(fā)現(xiàn),進展期中度以上的白癜風(fēng)患者血清中存在不飽和脂肪酸代謝通路失衡。既往研究發(fā)現(xiàn),高脂肪飲食會增加患白癜風(fēng)的風(fēng)險;同時,血清中的硬脂酸及總脂肪酸的代謝譜與多種自身免疫性疾病(包括白癜風(fēng))發(fā)病相關(guān),可以作為疾病早期診斷的輔助工具[11]。氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)發(fā)病中起到一定作用,其導(dǎo)致外泌體和炎性細(xì)胞因子的釋放,從而激活免疫反應(yīng)攻擊黑素細(xì)胞,促進疾病發(fā)展[12]。游離脂肪酸,如硬脂酸,二十碳五烯酸,會導(dǎo)致高活性氧簇和活性氮簇生成增多,從而啟動氧化應(yīng)激機制[13]。本研究發(fā)現(xiàn),硬脂酸和二十碳五烯酸代謝異常,并且富集在白癜風(fēng)患者的不飽和脂肪酸代謝通路,這與已發(fā)表的文獻一致[7],提示此異常通路可能參與白癜風(fēng)中氧化應(yīng)激反應(yīng)的啟動從而促進疾病的發(fā)生發(fā)展,但其具體機制仍需進一步探究。

同時,本研究發(fā)現(xiàn)進展期白癜風(fēng)組泛酸含量下降。泛酸也稱維生素B5,是維持生命所必需的水溶性維生素,是形成三羧酸循環(huán)和脂肪酸代謝的關(guān)鍵輔助因子輔酶A所必需,因此其缺乏可能會影響脂肪酸代謝,引起白癜風(fēng)患者體內(nèi)的不飽和脂肪酸代謝失衡,促進疾病的發(fā)生[14]。

目前有文獻表明,胡椒堿可促進黑素細(xì)胞黑色素的生成,調(diào)節(jié)免疫,可刺激體外黑素細(xì)胞復(fù)制,有助于治療白癜風(fēng)[15]。本研究表明,進展期白癜風(fēng)患者相比健康對照血清中胡椒堿含量顯著下降,推測可能是患者飲食中胡椒堿的攝入不足或者吸收障礙有關(guān),在未來對白癜風(fēng)患者的飲食中補充胡椒堿可能成為本病治療的有利手段之一。

咪唑乙酸,在人體中參與組氨酸代謝,是組胺的代謝產(chǎn)物。有文獻報道,組胺參與免疫炎癥,并且在一些白癜風(fēng)的發(fā)病中起重要作用,從而促進產(chǎn)生伴瘙癢的色素減退斑[16]。結(jié)合本研究中咪唑乙酸含量的上升,推斷組胺代謝增多可能引起色素脫失。因此,后續(xù)可進一步探究白癜風(fēng)患者與組胺代謝的相關(guān)性。

氧化應(yīng)激和免疫失衡在白癜風(fēng)的發(fā)病機制中起重要作用,膽紅素是一種強大的抗氧化劑,也被認(rèn)為是自身免疫性疾病的保護因子[17]。本研究結(jié)果表明,進展期血清中膽紅素增高,故推測隨著病情進行,膽紅素可能作為免疫調(diào)節(jié)劑在機體中上調(diào)來調(diào)控免疫反應(yīng),但仍需深入探索其機制。

硬脂酰乙醇酰胺和油酰乙醇酰胺,這二者均是具有鎮(zhèn)痛和抗炎特性的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)[18]。它們的升高,可能是機體對白癜風(fēng)進展過程發(fā)生的大量免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控。同時有文獻報道,硬脂酰乙醇酰胺可促進細(xì)胞凋亡[19],故推測白癜風(fēng)患者體內(nèi)硬脂酰乙醇酰胺含量升高可能會促進黑素細(xì)胞凋亡,進而引起色素脫失。

本研究存在不足之處:①本研究僅為橫斷面研究,雖出現(xiàn)了許多有意義的結(jié)果,但缺乏大樣本及前瞻隊列研究;②僅考慮了進展期白癜風(fēng)患者,尚未納入穩(wěn)定期患者,疾病代表性較小,有可能漏掉了有關(guān)該疾病的重要代謝特征;③采用非靶向LC-MS檢測技術(shù),未對代謝物進行定量分析;④對差異性代謝物及其通路的預(yù)測并未加以驗證。這些是本課題組后續(xù)需要完善和探索的方向。

本研究通過LC-MS技術(shù)首次對中國漢族人群進展期白癜風(fēng)患者血清代謝組學(xué)進行研究,發(fā)現(xiàn)10種異常代謝物及不飽和脂肪酸生物合成通路與本病相關(guān),探討了部分代謝產(chǎn)物的病理生理功能,為進一步研究白癜風(fēng)提供了更多的線索。