唐情,汪海珍,汪碧瀅,易婷婷,王力,羅菲菲,冉崇軍,羅美俊子,嚴伊寧,黃盼,彭友華,潘意,周蓉

特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)是常見的慢性、炎癥性皮膚病,患者常伴有皮膚干燥、劇烈瘙癢,還具有反復發(fā)病的特點[1]。全球約有15%～30%的兒童和2%～10%的成年患有AD,并受劇烈瘙癢帶來的困擾,是全球的一大公共問題[2]。目前發(fā)現(xiàn),AD發(fā)病可能與遺傳、免疫異常、皮膚屏障功能異常有關,但具體病因尚未十分明確。AD治療上以常規(guī)外用藥為主,必要時口服藥物或進行物理治療,雖然可短暫緩解,但是有反復發(fā)病的風險[3]。近年來,隨著對AD發(fā)病機制的深入了解,小分子靶向精準治療及生物制劑也逐漸應用于臨床,給中、重度患者的治療帶來希望。因此,本研究擬通過生物信息學分析相關基因芯片篩選AD差異表達基因,并進行功能分析及通路富集。篩選差異最為顯著的基因驗證使用度普利尤單抗或環(huán)孢素系統(tǒng)治療后的表達變化,并進一步在動物水平驗證該差異基因的表達水平及功能作用,以期為緩解AD疾病提供新的作用靶標。

1 材料與方法

1.1生物信息學分析

1.1.1篩選差異表達基因 在基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus, GEO)下載AD相關基因芯片GSE157194(包含57例AD患者皮損組織樣本、54例正常皮膚組織樣本、21例使用度普利尤單抗及8例使用環(huán)孢素系統(tǒng)治療后3個月的AD患者皮損組織樣本。從GPL21290 Illumina HiSeq 3000 (Homo sapiens)獲取注釋信息,利用R語言包及l(fā)imma工具包對相關數(shù)據(jù)芯片數(shù)據(jù)集進行分析,篩選出差異表達基因(differentially expressed gene, DEGs)(|log2FC|>1,P<0.05)。

1.1.2DEGs的GO功能富集和PPI分析 本研究通過Metascape在線分析工具(http://meta-scape.org)對篩選得到的DEGs進行基因本體論(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析,設置P<0.05。

1.2動物實驗

1.2.1實驗動物 6周齡無特定病原體(specific pathogen free, SPF)清潔級BALB/c雄性小鼠購自于湖南斯萊克景達公司,所有小鼠飼養(yǎng)溫度為20～25 ℃,相對濕度為45%～60%,晝夜交替12 h,自由攝食、飲水,嚴格遵循國家動物飼養(yǎng)規(guī)則飼養(yǎng)1周進行實驗。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.2.2實驗材料 二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)購自上海晅科生物科技有限公司;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色試劑盒、多聚甲醛購自上海碧云天生物技術有限公司;基因組提取試劑盒、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)產(chǎn)物純化試劑盒及反轉錄試劑盒購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司;放射免疫沉淀法緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer, RIPA裂解液)、Bradford蛋白檢測試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司;酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;Lipo-fectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司;腺病毒載體GV314、大腸桿菌菌株DH5α購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.2.3小鼠分組及模型構建 將16只BALB/c小鼠隨機分為對照組、模型組、OE-NC組、OE-Krüppel樣因子15(Krüppel like factor 15, KLF15)組,每組4只。對照組小鼠不做任何處理,模型組小鼠耳部脫毛后使用2% DNCB及溶液(丙酮∶橄欖油3∶1)涂抹誘導造模,涂抹至21 d,前期1次/d,自第8天起,隔天1次。OE-NC組及OE-KLF15組分別在小鼠皮損處分多點均勻皮內注射空載質粒或KLF15過表達質粒,注射間距約為0.5 cm。

1.2.4HE染色 造模成功后,處死實驗小鼠,取小鼠耳部皮損部位組織,在4%甲醛中固定24 h,生理鹽水沖洗并在PBS溶液中浸泡。使用濃度梯度的酒精脫水并進行透明處理,包埋后制成石蠟切片,烤干后進行透明脫蠟,使用HE染色后封片。光學顯微鏡下觀察各組小鼠的皮膚組織的病理學變化。光學顯微鏡下觀察皮損內3個不重疊視野,并計數(shù)炎癥細胞數(shù)量。

1.2.5qPCR 提取總RNA 使用紫外分光光度計檢測OD260/OD280處的吸收峰并檢測其濃度,將RNA反轉錄獲得相應的cDNA,使用PCR儀擴增并分析相對應的mRNA。GAPDH為內參,以2-ΔΔCT法計算mRNA相對表達水平。

1.2.6Western blot 選取小鼠皮損組織切碎后放入相應AP管中,加入裂解液后置于冰上靜置裂解。在勻漿機中進行勻漿后使用離心機離心,取上清液煮沸變性。使用BCA蛋白檢測試劑盒測定總蛋白含量,將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳轉移至過濾膜上,室溫下使用5%脫脂奶粉TBST封閉并孵育2 h,添加相關抗體孵育至過夜,洗滌后再加入二抗,室溫下孵育2 h。然后使用ECL底物觀察檢測蛋白質的表達水平,GAPDH作為內源性對照。

1.2.7ELISA 摘取小鼠眼球進行取血,并分離血清,使用ELISA試劑盒檢測白細胞介素(interleukin, IL)-4、IL-13、IL-31和干擾素γ(interferon, IFN-γ)。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。配制相應濃度梯度的標準液,與待測樣品混勻后在37 ℃條件下加熱,加入相關抗體稀釋液后繼續(xù)孵育。30 min后加入添加親和素過氧化物酶復合物繼續(xù)孵育。顯色反應終止后,使用酶標儀測定450 nm波長的吸光度值,通過標準曲線的繪制計算相應的濃度。

2 結果

2.1篩選AD皮損組織中的差異表達基因 基于GSE157194測序數(shù)據(jù),分析比較AD患者皮損組織樣本與正常皮膚組織樣本之間的DEGs,獲得74個下調的DEGs(|log2FC|<-1,P<0.05)及331個上調的DEGs(|log2FC|>1,P<0.05),見圖1。

圖1 AD皮損組織中的差異表達基因熱圖

2.2DEGs的GO功能富集分析 使用Metascape在線分析,對篩選到的331個上調DEGs及74個下調DEGs進行GO功能富集分析。GO分析結果顯示,DEGs主要與細菌應答、炎癥反應、Th2型免疫激活、皮膚發(fā)育、細胞離子代謝、調節(jié)類固醇代謝過程以及Wnt通路調控顯著相關,見圖2。

圖2 DEGs的GO功能富集分析

2.3DEGs的KEGG富集分析 蛋白質互作網(wǎng)絡的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),DEGs主要富集在病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號傳導途徑、Th1和Th2細胞的分化等過程,見圖3。

2.4KLF15在GSE157194芯片中的表達水平 GSE157194芯片結果顯示,與治療前正常皮膚組織樣本(AN)相比,皮損組織樣本(AL)中KLF15表達顯著下調(|log2FC|>1,P<0.05)。使用度普利尤單抗或環(huán)孢菌素治療3個月后,AN與AL中KLF15表達水平差異無統(tǒng)計學意義(|log2FC|>1,P>0.05),見圖4。

2.5KLF15在AD小鼠皮損組織中的表達水平 構建AD小鼠模型,HE染色觀察小鼠皮膚病理變化并計數(shù)炎癥細胞數(shù)量。qPCR及Western blot檢測KLF15在小鼠皮損組織中的表達水平。結果顯示,對照組小鼠表皮、真皮結構正常,無炎性細胞浸潤。模型組小鼠出現(xiàn)棘層肥厚、真皮層水腫并伴有大量炎細胞浸潤。與對照組小鼠比較,AD小鼠皮損組織中炎癥細胞計數(shù)顯著上調(t=16.01,P<0.01),KLF15 mRNA及蛋白水平顯著下調(t=10.02、10.34,P<0.01),見圖5。

Note: Compared with the control group, **P<0.01.

2.6KLF15對小鼠血清中Th1、Th2細胞相關因子的影響 構建KLF15過表達質粒,將KLF15過表達質粒注射至模型小鼠,通過qPCR及Western blot檢測轉染效率(t=34.74、24.26,P<0.01),見圖6。并通過ELISA檢測小鼠血清Th2相關因子IL-4、IL-13、IL-31和IFN-γ的表達水平。結果顯示,與OE-NC組比較,OE-KLF15組小鼠的IL-4、IL-13和IL-31的表達水平顯著下調(t=16.80、18.06、16.12,P<0.01),IFN-γ的表達水平顯著上升(t=10.75,P<0.01),見圖7。

Note: Compared with OE-NC group, **P<0.01.

Note: Compared with OE-NC group, **P<0.01.

3 結論

AD是影響兒童和成年人最常見的炎癥性皮膚病之一,劇烈的瘙癢及皮疹嚴重影響患者生活質量及日常工作[4]。在治療方面,輕度患者在臨床常使用皮膚護理聯(lián)合外用抗炎藥物有較好的療效,但針對重度及反復發(fā)作的AD患者的治療,目前仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)[5]。隨著精準醫(yī)療的快速發(fā)展,各種疾病的靶向分子及相關藥物的研究在醫(yī)學界廣泛進行,針對AD相關治療靶點的研究也逐步開展。

本研究首先基于AD相關基因芯片GSE157194篩選出DEGs,進一步經(jīng)GO功能富集及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),AD皮損組織DEGs主要與細菌應答、炎癥反應、Th2型免疫等功能顯著相關。在上述篩選出的DEGs中,KLF15與AD之間關聯(lián)性的研究報道較少,但這一基因在皮損組織中顯著下調,且使用度普利尤單抗或者環(huán)孢菌素等系統(tǒng)治療3個月后,KLF15在AD皮損處與正常皮膚組織之間的表達水平差異無統(tǒng)計學意義,所以KLF15可能是AD的潛在治療靶點,表達水平可能能夠作為臨床AD治療效果的參考。KLF15具有抗纖維化作用,可有效抑制肝組織纖維化[6]及腎臟纖維化[7]等相關疾病的進展,但其在AD進展中發(fā)揮作用的具體機制尚未闡明。

眾所周知,AD進展中的炎癥反應是Th2型免疫功能亢進的常見后果[8],Th1/Th2在健康的機體內處于動態(tài)平衡,可進一步維持機體免疫系統(tǒng)的平衡狀態(tài)[9]。Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-β等炎癥因子,介導細胞免疫;Th2細胞主要分泌IL-4、IL-13、IL-31等炎癥因子,介導體液免疫,引起Ⅰ型超敏反應的發(fā)生[10]。IL-4、IL-13和IL-31炎癥通路已被確定為AD發(fā)病機制的標志性特征,對免疫和屏障異常以及瘙癢等關鍵癥狀具有獨特作用[11]。有研究[12]發(fā)現(xiàn),SKP2通過抑制FOXO3/KLF15/LRP5軸增強卵清蛋白(ovalbumin,OVA)誘導的大鼠模型中的氣道高反應性和炎癥,增加了IL-4、IL-5、IL-13等Th2型炎癥表達因子的水平。因此推測,KLF15可能通過促進Th1細胞功能,抑制Th2細胞功能在緩解AD中發(fā)揮作用。因此,本研究通過小鼠體內轉染過表達KLF15,研究其對小鼠血清IL-4、IL-13、IL-31及IFN-γ的影響,以證實KLF15對Th1/Th2軸的調控作用。本研究結果顯示,過表達KLF15可有效下調小鼠血清中Th2相關炎癥因子IL-4、IL-13和IL-31的表達水平,上調Th1相關炎癥因子IFN-γ的表達水平。

綜上所述,生物信息學分析顯示KLF15在AD患者皮損部位顯著下調,且使用度普利尤單抗或者環(huán)孢菌素等系統(tǒng)治療3個月后,KLF15表達水平有所上調。動物實驗中實現(xiàn)KLF15過表達,可調控小鼠血清中Th1/Th2平衡,緩解AD小鼠的疾病進展,為治療AD提供潛在的作用靶點。