齊立攀,趙亞平,劉競,閆軍飛,龐利霞

在紫外線輻射,特別是長波紫外線(ultraviolet A,UVA)輻射下,皮膚真皮組織中成纖維細(xì)胞易受到紫外線照射發(fā)生氧化損傷,引起紅斑、皮膚干燥、色素沉著、炎癥反應(yīng)、皮膚松弛、皺紋增加等皮膚性疾病,嚴(yán)重時甚至可引起皮膚癌(包括黑素瘤和非黑素瘤)[1-2]。因此,需要找到一種可針對性防治UVA引起皮膚光損傷的方法。近年,許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)皮膚組織中微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)與皮膚成纖維細(xì)胞的生長、增殖和抗氧化等生理過程有密切關(guān)系[3],然而其具體機(jī)制不明確。有研究[4]發(fā)現(xiàn),磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路與氧化損傷密切相關(guān),調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路可保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免于氧化應(yīng)激損傷。因此,本研究通過建立UVA照射誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞光損傷模型,采用慢病毒上調(diào)miR-21表達(dá),觀察miR-21過表達(dá)對光損傷模型人皮膚成纖維細(xì)胞生物活性、氧化損傷及PTEN/PI3K/AKT信號通路的影響,以期為紫外線輻射的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人皮膚成纖維細(xì)胞(批號:CLH50193)購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司。

1.1.2試劑與儀器 miR-21模擬物(miR-21 mi-mics)及其陰性對照(miR-21 NC)慢病毒載體(批號分別為2375S和6637S)均購自上海吉凱基因有限公司;PI3K抑制劑LY294002、PI3K激活劑740Y-P(批號分別為IHK-007和ISK-009)均購自北京西美杰科技有限公司;Trizol試劑、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、BCA試劑盒、ECL顯色試劑盒(批號分別為4860-056、2903-062、5063-117、2378-021)均購自北京啟維益成科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、β-半乳糖苷酶染色試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、RIPA裂解緩沖液(批號分別為CK90172、CK2920、CK8316、CK2837、CK3899、CK8249、CK3487)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔源PTEN、PI3K、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)、β-肌動蛋白(β-actin)一抗、羊抗兔二抗(批號分別為BC2873、BC4308、BC2908、BC2938、BC4509、BC4305)均購自北京凱瑞力楓科貿(mào)有限公司;CO2孵育箱(型號WJ-80A)、UVA發(fā)生器(型號SS-08A)、熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號FQD-98C)均購自合肥市瑞思奇科研儀器有限公司;光學(xué)顯微鏡(型號SMZ25)、酶標(biāo)儀(型號TECAN spark)均購自北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司;凝膠成像系統(tǒng)(型號SH-520)購自上海智巖科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 人皮膚成纖維細(xì)胞接種于用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃ 環(huán)境中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞以密度1×106個/mL接種200 μL于24孔板,并分為4組:空白對照組、UVA組、UVA+NC組、UVA+miR-21 mimics組、UVA+miR-21 mimics+PI3K抑制劑組、UVA+miR-21 mimics+PI3K激活劑組。除空白對照組外,其余各組細(xì)胞均用UVA發(fā)生器在距離細(xì)胞15 cm處照射,照射劑量為10 J/cm2,時間為12 min[5],照射完畢后更換新的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基;照射1次/d,連續(xù)照射7 d。空白對照組細(xì)胞不接受UVA照射,正常培養(yǎng)。

取4支EP管,第1支加入miR-21 NC慢病毒載體(24 μL)和完全培養(yǎng)基(180 μL),第2支加入miR-21 mimics慢病毒載體(24 μL)和完全培養(yǎng)基(180 μL),第3支加入miR-21 mimics慢病毒載體(24 μL)和含50 μmol/L PI3K抑制劑LY294002[6]的完全培養(yǎng)基(180 μL),第4支加入miR-21 mimics慢病毒載體(24 μL)和含50 μmol/L PI3K激活劑740Y-P的完全培養(yǎng)基(180 μL),混勻。將EP管中的miR-21 NC慢病毒載體和完全培養(yǎng)基、miR-21 mimics慢病毒載體和完全培養(yǎng)基、miR-21 mimics慢病毒載體和含50 μmol/L PI3K抑制劑LY294002的完全培養(yǎng)基、miR-21 mimics慢病毒載體和含50 μmol/L PI3K激活劑740Y-P的完全培養(yǎng)基,分別加入UVA照射處理后的UVA+NC組、UVA+miR-21 mimics組、UVA+miR-21 mimics+PI3K抑制劑組、UVA+miR-21 mimics+PI3K激活劑組中;空白對照組和UVA組分別加入204 μL完全培養(yǎng)基;培養(yǎng)24 h。各組均設(shè)置6次重復(fù)。

1.2.2qRT-PCR法檢測人皮膚成纖維細(xì)胞中miR-21的表達(dá) 用Trizol試劑從轉(zhuǎn)染繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞中提取總RNA,每組吸取2 μg RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,將qRT-PCR反應(yīng)體系置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),參數(shù)為95 ℃預(yù)變性11 min;95 ℃ 變性30 s、56 ℃ 退火20 s、72 ℃延伸40 s,39個循環(huán)。具體反應(yīng)環(huán)境、條件參照PCR試劑盒說明書進(jìn)行。以U6為內(nèi)參,采用2-△△Ct法分析miR-21相對表達(dá)量。引物由上海博爾森生物科技有限公司設(shè)計合成,所用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3CCK-8法檢測人皮膚成纖維細(xì)胞活力 將轉(zhuǎn)染繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞接種在48孔板上(5×103/孔),每孔中加入14 μL CCK-8溶液,4 h后酶標(biāo)儀檢測590 nm處的吸光度,并計算細(xì)胞活力(細(xì)胞活力=各干預(yù)組吸光度/空白對照組吸光度×100%)。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞,胰蛋白酶消化,用PBS緩沖液將細(xì)胞重懸為2×105個/mL的細(xì)胞懸液,加入Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)各15 μL 孵育24 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5β-半乳糖苷酶染色法觀察人皮膚成纖維細(xì)胞衰老情況 取轉(zhuǎn)染繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后的細(xì)胞,添加2 mL β-半乳糖苷酶染色液,室溫固定30 min。PBS清洗3次,3 min/次。顯微鏡下觀察染色結(jié)果,隨機(jī)選取5個視野范圍細(xì)胞,高倍鏡下進(jìn)行衰老細(xì)胞(染色為深藍(lán)的細(xì)胞)計數(shù),計算衰老細(xì)胞比例(衰老細(xì)胞比例=鏡下衰老細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%),取平均值。

1.2.6ELISA法檢測人皮膚成纖維細(xì)胞中SOD和MDA含量 用細(xì)胞刮收集轉(zhuǎn)染繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞,1 300 r/min離心7 min,棄上清,PBS清洗3次,沉淀中加入500 μL雙蒸水,在冰浴上勻漿3 min,2 500 r/min離心14 min,取上清液按照SOD和MDA ELISA試劑盒說明書,使用酶標(biāo)儀測定SOD和MDA含量。

1.2.7蛋白印跡法檢測人皮膚成纖維細(xì)胞中 PTEN/PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞,PBS清洗后加入RIPA裂解液,提取蛋白并定量蛋白濃度,取58 μg蛋白進(jìn)行電泳,蛋白切膠,轉(zhuǎn)膜,加入兔源PTEN(1∶750)、PI3K(1∶500)、p-AKT(1∶510)、AKT(1∶510)、內(nèi)參β-actin(1∶1 200)一抗孵育,放置4 ℃過夜,TBST清洗,加入羊抗兔二抗(1∶2 300)孵育3 h,加入ECL發(fā)光液對蛋白進(jìn)行顯影。Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1各組人皮膚成纖維細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平比較 與空白對照組(1.00±0.00)相比,UVA組(0.69±0.07)、UVA+NC組(0.64±0.06)人皮膚成纖維細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平顯著降低(q=4.514、5.329,P<0.05);與UVA組和UVA+NC組相比,UVA+miR-21 mimics組(2.18±0.20)、UVA+miR-21 mimics+PI3K抑制劑組(2.14±0.22)、UVA+miR-21 mimics+PI3K激活劑組(2.21±0.27)人皮膚成纖維細(xì)胞miR-21表達(dá)水平顯著升高(q=21.695、21.113、22.132,22.511、21.928、22.948,P<0.05);UVA+miR-21 mimics組、UVA+miR-21 mimics+PI3K抑制劑組、UVA+miR-21 mimics+PI3K激活劑組人皮膚成纖維細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q=0.582、0.437、1.019,P>0.05)。

2.2各組人皮膚成纖維細(xì)胞活力、凋亡率、衰老細(xì)胞比例比較 與空白對照組相比,UVA組、UVA+NC組人皮膚成纖維細(xì)胞活力顯著降低,凋亡率、衰老細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05);與UVA組和UVA+NC組相比,UVA+miR-21 mimics組、UVA+miR-21 mimics+PI3K激活劑組人皮膚成纖維細(xì)胞的活力顯著升高,凋亡率、衰老細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05);與UVA+miR-21 mimics組相比,UVA+miR-21 mimics+PI3K抑制劑組人皮膚成纖維細(xì)胞活力顯著降低,凋亡率、衰老細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05),UVA+miR-21 mimics+PI3K激活劑組人皮膚成纖維細(xì)胞活力顯著升高,凋亡率、衰老細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),見表2,圖1～2。

表2 各組人皮膚成纖維細(xì)胞活力、凋亡率、衰老細(xì)胞比例比較

Blank control group; UVA group; UVA+NC group; UVA+miR-21 mimics group; UVA+miR-21 mimics+PI3K inhibitor group; UVA+miR-21 mimics+PI3K activator group

Blank control group; UVA group; UVA+NC group; UVA+miR-21 mimics group; UVA+miR-21 mimics+PI3K inhibitor group; UVA+miR-21 mimics+PI3K activator group

2.3各組人皮膚成纖維細(xì)胞中SOD、MDA含量比較 與空白對照組相比,UVA組、UVA+NC組人皮膚成纖維細(xì)胞中MDA含量顯著升高,SOD含量顯著降低(P<0.05);與UVA組和UVA+NC組相比,UVA+miR-21 mimics組人皮膚成纖維細(xì)胞中MDA含量顯著降低,SOD含量顯著升高(P<0.05);與UVA+miR-21 mimics組相比,UVA+miR-21 mimics+PI3K抑制劑組人皮膚成纖維細(xì)胞中MDA含量顯著升高,SOD含量顯著降低(P<0.05),UVA+miR-21 mimics+PI3K激活劑組人皮膚成纖維細(xì)胞中MDA含量顯著降低,SOD含量顯著升高(P<0.05),見表3。

表3 各組人皮膚成纖維細(xì)胞中SOD、MDA含量比較

2.4各組人皮膚成纖維細(xì)胞PTEN/PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與空白對照組相比,UVA組、UVA+NC組人皮膚成纖維細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高,PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與UVA組和UVA+NC組相比,UVA+miR-21 mimics組人皮膚成纖維細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平顯著降低,PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與UVA+miR-21 mimics組相比,UVA+miR-21 mimics+PI3K抑制劑組人皮膚成纖維細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),UVA+miR-21 mimics+PI3K激活劑組人皮膚成纖維細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);6組人皮膚成纖維細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖3,表4。

Note:A indicated Blank control group; B indicated UVA group; C indicated UVA+NC group; D indicated UVA+miR-21 mimics group; E indicated UVA+miR-21 mimics+PI3K inhibitor group;F indicated UVA+miR-21 mimics+PI3K activator group.

表4 各組人皮膚成纖維細(xì)胞PTEN/PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

3 討論

太陽光中紫外輻射波長主要包括UVA(320～420 nm)、中波紫外線(UVB,275～320 nm)和短波紫外線(UVC,200～275 nm)[7],長期暴露于UVA可通過誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生和DNA損傷來激活下游信號和炎性細(xì)胞因子的形成,從而引起皮膚損傷和光老化[8]。目前尚無藥物針對性預(yù)防或治療UVA導(dǎo)致的皮膚損傷性疾病。近年越來越多的證據(jù)表明miRNAs可用于修復(fù)皮膚損傷。miRNAs是一類新型內(nèi)源性、小分子非編碼RNA,通過誘導(dǎo)靶mRNAs降解或抑制翻譯負(fù)調(diào)節(jié)50%以上人類基因的表達(dá)[9]。其中miR-21可參與免疫應(yīng)答、自身免疫性疾病、創(chuàng)傷愈合過程、纖維化等多種病理生理過程[10-11]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),miR-21能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、遷移、膠原合成和增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成活性,利于皮膚損傷區(qū)愈合[12]。miR-21可促進(jìn)皮膚損傷區(qū)皮膚再生,在皮膚損傷后上調(diào)miR-21表達(dá)可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移,加速損傷區(qū)皮膚的再生[13]。抑制miR-21可明顯延遲損傷面愈合,損傷面成纖維細(xì)胞和膠原減少,因此miR-21是成纖維細(xì)胞功能的正調(diào)節(jié)因子[14-15]。本研究采用UVA照射人皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)光損傷模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),UVA照射的人皮膚成纖維細(xì)胞miR-21表達(dá)水平、活力降低,凋亡率、衰老細(xì)胞比例升高;經(jīng)miR-21 mimics慢病毒載體轉(zhuǎn)染的人皮膚成纖維細(xì)胞miR-21表達(dá)水平、活力升高,凋亡率、衰老細(xì)胞比例降低。提示上調(diào)miR-21可增強(qiáng)UVA誘導(dǎo)光損傷模型人皮膚成纖維細(xì)胞生物活性。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致許多不良反應(yīng)和病理?xiàng)l件的原因[16],可導(dǎo)致細(xì)胞衰老凋亡。過量UVA照射可使皮膚的前氧化劑-抗氧化平衡向高度氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生過量活性氧,從而抑制抗氧化防御機(jī)制引起皮膚成纖維細(xì)胞DNAs、蛋白質(zhì)和其他生物大分子的氧化損傷細(xì)胞衰老、皺縮[17]。氧化和抗氧化系統(tǒng)的防御平衡受損,會導(dǎo)致氧化組織損傷,有研究報道[18-19]人皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷后會引起MDA含量升高,而SOD含量降低,增強(qiáng)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn),UVA誘導(dǎo)光損傷模型人皮膚成纖維細(xì)胞中MDA含量升高,SOD含量降低,提示UVA誘導(dǎo)光損傷模型人皮膚成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),miR-21 mimics慢病毒載體轉(zhuǎn)染的人皮膚成纖維細(xì)胞中MDA含量降低,SOD含量升高,提示上調(diào)miR-21可減輕UVA誘導(dǎo)光損傷模型人皮膚成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度,然而具體作用機(jī)制尚不清楚。

PTEN/PI3K/AKT通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中的重要通路。研究證實(shí),miR-21可通過PTEN/PI3K/AKT途徑增加人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá),抑制細(xì)胞衰老凋亡[20-21]。另有研究表明,miR-21可靶向腎纖維化成纖維細(xì)胞中PTEN表達(dá),誘導(dǎo)PI3K/AKT途徑激活[22]。本研究發(fā)現(xiàn),UVA誘導(dǎo)光損傷模型人皮膚成纖維細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)升高,PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)降低;經(jīng)miR-21 mimics慢病毒載體轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)降低,PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)升高;提示miR-21過表達(dá)可能通過下調(diào)PTEN,激活PI3K/AKT信號通路,減輕UVA誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞損傷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-21過表達(dá)對PI3K/AKT信號通路的調(diào)控作用,本研究在miR-21 mimics慢病毒載體轉(zhuǎn)染UVA誘導(dǎo)光損傷模型人皮膚成纖維細(xì)胞的基礎(chǔ)上,采用PI3K抑制劑LY294002和PI3K激活劑740Y-P分別進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示,PI3K抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)miR-21過表達(dá)對UVA誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,而PI3K激活劑740Y-P則可增強(qiáng)miR-21過表達(dá)對UVA誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞損傷的保護(hù)效果。

綜上所述,上調(diào)miR-21可增強(qiáng)UVA誘導(dǎo)光損傷模型人皮膚成纖維細(xì)胞活力,抑制其凋亡、衰老和氧化損傷,可能與調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號通路有關(guān)。但本研究還存在一定的局限性,miR-21對人皮膚成纖維細(xì)胞生物活性、氧化損傷的影響可能涉及其他通路,有待深入研究。