陳永豪

摘 要 近年來(lái)，曼陀羅在我國(guó)呈迅速蔓延之勢(shì)，已被劃分為入侵植物。入侵植物會(huì)壓制或排擠本地物種，破壞當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)多樣性。研究入侵植物的葉綠體基因組遺傳多樣性對(duì)了解入侵植物的入侵機(jī)制具有重要意義，而利用葉綠體基因組通用引物對(duì)葉綠體基因組進(jìn)行擴(kuò)增是研究葉綠體基因組遺傳多樣性的有效方法。為加強(qiáng)曼陀羅葉綠體基因組的遺傳多樣性、單倍型分析及譜系地理學(xué)等研究，利用查找相關(guān)文獻(xiàn)得到的15對(duì)葉綠體基因組通用引物對(duì)曼陀羅葉綠體基因組非編碼區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增，共篩選出7對(duì)葉綠體基因組通用引物可以用于曼陀羅葉綠體基因組非編碼區(qū)片段的擴(kuò)增和后續(xù)的測(cè)序工作。

關(guān)鍵詞 入侵植物；曼陀羅；葉綠體基因組；通用引物；西藏自治區(qū)

中圖分類號(hào)：S567.21 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.02.077

曼陀羅（Datura stramonium Linn.）是茄科曼陀羅屬一年生草本植物，原產(chǎn)于墨西哥，主要分布在溫帶與熱帶地區(qū)，在我國(guó)各地區(qū)均有分布[1-2]。曼陀羅常被當(dāng)作觀賞植物栽培，曾作為藥用植物引入我國(guó)，但由于長(zhǎng)期缺乏規(guī)范性的入侵檢疫等原因，曼陀羅在我國(guó)大范圍蔓延與擴(kuò)散，目前已被劃分為入侵植物[3-6]。曼陀羅具有很強(qiáng)的化感作用，能夠抑制黃瓜、小麥、蘿卜等作物的生長(zhǎng)，對(duì)棉花、豆類、薯類、蔬菜和玉米等作物有不利影響，易給被入侵地的生物多樣性與生態(tài)環(huán)境帶來(lái)潛在危害。葉綠體是一種廣泛存在于高等植物和一些藻類中的半自主細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所。葉綠體基因組作為直系同源基因，其不易受到旁系同源基因的干擾、在被子植物中遺傳方式為母系遺傳、不易發(fā)生重組、便于組裝的特點(diǎn)使其具有易解析的特性，被廣泛應(yīng)用于植物的系統(tǒng)發(fā)育分析、物種鑒定、葉綠體基因工程、分析演化路徑及遺傳進(jìn)化等研究。目前，有關(guān)曼陀羅的研究主要涉及曼陀羅的傳粉生物學(xué)研究、曼陀羅在重金屬污染下的種群遺傳結(jié)構(gòu)研究、曼陀羅種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)及關(guān)于曼陀羅作為藥用植物有效成分的提取和活性成分的評(píng)價(jià)等，關(guān)于分布于西藏自治區(qū)的曼陀羅葉綠體基因組通用引物篩選的相關(guān)研究還未見報(bào)道。本文通過(guò)查找相關(guān)文獻(xiàn)，得到15對(duì)葉綠體基因組通用引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)分布于西藏自治區(qū)的曼陀羅葉片DNA進(jìn)行擴(kuò)增，旨在篩選出能夠用于后續(xù)測(cè)序及進(jìn)一步分析曼陀羅葉綠體基因組遺傳多樣性、單倍型、譜系地理、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳分化等研究的葉綠體基因組通用引物，為進(jìn)一步揭示曼陀羅的入侵機(jī)制及防控措施的制訂提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 曼陀羅葉片

結(jié)合曼陀羅的生長(zhǎng)環(huán)境特點(diǎn)，于2020—2021年夏天在西藏自治區(qū)朗縣、尼木縣、白朗縣、加查縣、南木林縣、波密縣、貢嘎縣、八宿縣、芒康縣、工布江達(dá)縣、察隅縣、仁布縣、林芝市、山南市和拉薩市等地的花壇、垃圾堆、荒地及住宅附近，采集曼陀羅新鮮的嫩葉置于預(yù)先準(zhǔn)備好的分子袋中，并將分子袋迅速放到藍(lán)色變色硅膠中對(duì)葉片進(jìn)行快速干燥，并及時(shí)更換變質(zhì)為紅色的藍(lán)色硅膠直至葉片完全干燥。

1.1.2 葉綠體基因組通用引物

通過(guò)查詢?nèi)~綠體基因組通用引物相關(guān)文獻(xiàn)，選擇其中15對(duì)通用引物（見表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 曼陀羅葉片DNA的提取

采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒DP321進(jìn)行曼陀羅葉片DNA的提取，操作步驟如下。

1）取完全干燥的曼陀羅葉片約20 mg，與鋼珠一起加入2 mL離心管中做好標(biāo)記，放到FastPrep-24中充分研磨。

2）在離心管中加入400 μL緩沖液FP1和6 μL的

RNase A（分解RNA），在渦旋振蕩儀上振蕩1 min，然后在室溫下放置10 min。

3）在離心管中加入130 μL緩沖液FP2，充分混勻后在渦旋振蕩儀上振蕩1 min。

4）將離心管置于高速離心機(jī)中，以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min后，用移液槍吸取200 μL上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中并做好標(biāo)記。

5）向上清液中加入140 μL異丙醇，充分混勻后在高速離心機(jī)中以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心2 min，然后將上清液舍棄，保留沉淀。

6）加入600 μL質(zhì)量濃度為70%的乙醇，在渦旋振蕩儀上振蕩5 s后，在高速離心機(jī)中以12 000 r·min-1

的轉(zhuǎn)速離心2 min，舍棄上清液，保留沉淀。

7）重復(fù)操作步驟6。

8）打開離心管的管蓋，在室溫下倒置10 min，徹底晾干乙醇，避免對(duì)后續(xù)的PCR反應(yīng)造成影響。

9）加入200 μL洗脫緩沖液TE，在65 ℃水浴鍋中水浴10 min，期間不斷進(jìn)行顛倒混勻，以溶解DNA，最后得到DNA溶液。

1.2.2 DNA質(zhì)量檢測(cè)

曼陀羅葉片DNA提取完成后，對(duì)DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察條帶清晰度，確定DNA的質(zhì)量是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，將質(zhì)量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的DNA進(jìn)行分裝，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的DNA放置于-20 ℃冰箱中保存，其余DNA放置于-80 ℃的冰箱中進(jìn)行保存。

1.2.3 曼陀羅葉綠體基因組通用引物的篩選

在不同退火溫度（55 ℃、52 ℃、50 ℃、48 ℃、45 ℃）下，用15對(duì)引物對(duì)曼陀羅葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以篩選出曼陀羅葉綠體基因組通用引物。

1）PCR反應(yīng)體系的配制。PCR反應(yīng)體系共計(jì)

50 μL，分別為1 μL DNA、2 μL正向引物、2 μL反向引物、25 μL Taq PCR MasterMix、20 μL ddH2O。

2）PCR反應(yīng)程序的設(shè)定。根據(jù)生工生物工程（上海）股份有限公司提供的退火溫度將退火溫度設(shè)置為55 ℃、52 ℃、50 ℃、48 ℃、45 ℃。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋孩?4 ℃預(yù)變性3 min；②94 ℃變性30 s；③退火溫度下維持30 s；④72 ℃延伸1 min；⑤步驟②～④循環(huán)30次后72 ℃下保存5 min。

3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。吸取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將電泳結(jié)果置于凝膠成像分析儀下進(jìn)行拍照記錄，篩選5個(gè)退火溫度下出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的通用引物。

2 結(jié)果與分析

5個(gè)退火溫度下，15對(duì)葉綠體基因組通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果如表2所示，出現(xiàn)單清晰帶表示該引物可以擴(kuò)增出單一清晰的特異性條帶，能夠用于曼陀羅葉綠體基因組的擴(kuò)增和后續(xù)的測(cè)序工作；出現(xiàn)無(wú)帶、多條帶、單條帶不清晰則表示該引物擴(kuò)增出來(lái)的條帶不具有單一性和特異性，不能用于曼陀羅葉綠體基因組的擴(kuò)增和后續(xù)研究。

由表2可知，5個(gè)退火溫度下，從15對(duì)葉綠體基因組通用引物中共篩選出7對(duì)可擴(kuò)增出單清晰帶的引物。其中在退火溫度55 ℃條件下，僅引物5可擴(kuò)增出單清晰帶；退火溫度50 ℃條件下，引物1、引物2、引物3、引物4可擴(kuò)增出單清晰帶；退火溫度48 ℃條件下，引物14可擴(kuò)增出單清晰帶；其余引物在5個(gè)退火溫度條件下均未擴(kuò)增出單清晰帶。

此外，7對(duì)引物擴(kuò)增曼陀羅葉綠體基因組的區(qū)域分別為trnL-trnF、trnT-trnL、atpB-rbcL、trnS-psbC，

其中引物2、引物3、引物5、引物14分別在退火溫度50 ℃、50 ℃、55 ℃、48 ℃條件下擴(kuò)增出trnL-trnF，

說(shuō)明曼陀羅葉綠體基因組片段trnL-trnF在不同的引物及退火溫度下均易擴(kuò)增出清晰的特異性條帶，而其他擴(kuò)增區(qū)域只在特定退火溫度及特定引物下才能擴(kuò)增出特異性條帶，trnL-trnF更適用于曼陀羅葉綠體基因組后續(xù)研究。

3 結(jié)論與討論

21世紀(jì)以來(lái)，入侵生態(tài)學(xué)研究成為全球熱點(diǎn)之一[13]。隨著生物入侵現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，由生物入侵造成的生態(tài)資源破壞和經(jīng)濟(jì)損失也越來(lái)越大，嚴(yán)重影響著被入侵地的生態(tài)安全、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類健康等[14]。曼陀羅作為一種入侵植物，研究其葉綠體基因組的遺傳多樣性對(duì)了解曼陀羅的入侵機(jī)制進(jìn)而制定科學(xué)的防控措施具有重要意義，而對(duì)曼陀羅葉綠體基因組部分片段進(jìn)行測(cè)序是進(jìn)行曼陀羅葉綠體基因組遺傳多樣性等研究的有效方法，其中篩選曼陀羅葉綠體基因組通用引物可為后續(xù)測(cè)序和曼陀羅葉綠體基因組遺傳多樣性等方面的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本文通過(guò)查詢相關(guān)文獻(xiàn)獲得15對(duì)葉綠體基因組通用引物，對(duì)曼陀羅葉綠體基因組非編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)有7對(duì)引物在相應(yīng)的退火溫度下能夠擴(kuò)增出單一清晰的特異性條帶，其中曼陀羅葉綠體基因組片段

trnL-trnF在不同引物和退火溫度下均易擴(kuò)增出特異性條帶，更適合用于曼陀羅葉綠體基因組非編碼區(qū)的擴(kuò)增和后續(xù)的測(cè)序工作，對(duì)后續(xù)研究入侵植物曼陀羅葉綠體基因組的遺傳多樣性、單倍型分析及譜系地理學(xué)分析具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：劉寧寧）