周倩倩 沈振 王兆昆 張加余 汪冰 林永強

【摘 要】 目的：測定仙桃草中木犀草素、芹菜素、金圣草素等3種黃酮類成分的含量。方法：以甲醇提取制備分析樣品，采用納譜ChromeCore C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（23：77）為流動相，流速1 mL/min，檢測波長為350 nm（木犀草素、金圣草素）和337 nm（芹菜素），柱溫35 ℃。結果：木犀草素、芹菜素、金圣草素在各自范圍內線性關系良好（r≥0.9996），平均加樣回收率分別為97.79%、98.77%、97.28%，RSD分別為0.94%、0.91%、0.77%。13批樣品的木犀草素含量在0.0391～0.7979 mg/g之間，平均值為0.5503 mg/g；芹菜素含量在0.0556～0.2655 mg/g，平均值為0.1938 mg/g；金圣草素含量在0.0575～0.2484 mg/g，平均值為0.1711 mg/g。結論：該方法準確、可靠、重現性好，可用于仙桃草質量控制。

【關鍵詞】 仙桃草；HPLC雙波長切換；木犀草素；芹菜素；金圣草素

【中圖分類號】R284.1? ?【文獻標志碼】 A? ? 【文章編號】1007-8517（2023）08-0045-05

Abstract：Objective To determine the Luteolin，Apigenin and Chrysoeriol from Veronica peregrina L.by HPLC.Methods Samples for analysis were prepared by methanol，the analysis was performed on a 35℃ themostatic Nano ChromeCore C18 column（250 mmx4.6 mm， 5 μm）， with the mobile phase comprising of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （23∶77） flowing at 1.0 mL/min， and the detection wavelength were set at 350 nm for Luteolin and Chrysoeriol and 337 nm for Apigenin.Results Luteolin，Apigenin and Chrysoeriol show good linear relationships within their own ranges（r≥0.9996）， whose average recoveries were 97.79%， 98.77% and 97.28%， with the RSDs of 0.94%， 0.91% and 0.77%， respectively. The contents of the Luteolin， Apigenin and Chrysoeriol of the 13 samples were varied between 0.0391-0.7979 mg/g， 0.0556-0.2655 mg/g and 0.0575-0.2484 mg/g，with the averages of 0.5503 mg/g， 0.1938 mg/g and 0.1711 mg/g， respectively.Conclusion This accurate， reliable and reproducible method can be used for the quality control of Purslane Speedwell.

Key words：Purslane Speedwell; HPLC dual-wavelength method; Luteolin; Apigenin; Chrysoeriol

仙桃草為玄參科植物蚊母草Veronica peregrina L.帶蟲癭的干燥全草。蟲癭內的小蟲為象蟲科昆蟲仙桃草直喙象Gymnetron miyoshii Miyoshi。用于吐血、咯血、齟血、便血、跌打損傷，具有活血消腫、止血、止痛的作用［1］。金繼曙等［2］從仙桃草中分離出原兒茶酸、香草酸、木犀草素、金圣草素、甘露醇等5種化學成分。課題組研究發(fā)現仙桃草中含有芹菜素，并通過對照品定位、紫外吸收掃描、液相色譜-質譜聯(lián)用進行了確認。目前，仙桃草相關文獻報道較少，質量控制相對薄弱，劉華本等［3］、宋光偉等［4］分別對仙桃草中原兒茶酸、木犀草素的含量進行了測定，但金圣草素、芹菜素的測定尚未見文獻報道。木犀草素具有較好的促凝血作用［5］，芹菜素對腫瘤、衰老及心血管疾病有預防和控制作用［6］，金圣草素具有抗菌消炎的作用［7］。為有效控制仙桃草質量，研究建立木犀草素、芹菜素、金圣草素等3種黃酮類化合物的HPLC含量測定方法，為克服在同一波長下某些成分響應較低的缺點，提高各成分響應程度，使測定結果更加準確，需保證各成分在最大吸收波長處檢測，由于三種待測成分的最大紫外吸收波長存在差異，因此本研究采用波長切換法同時測定3種成分的含量，方法簡便、準確、靈敏，為完善和提高仙桃草質量標準提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津

LC-2030C 3D Plus

液相色譜儀，Mettler Toledo XSE205電子天平，納譜ChromeCore C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。

1.2 材料 木犀草素對照品（批號：111520-200504，含量100.0%，中國食品藥品檢定研究院），芹菜素對照品（批號：111901-202004，含量99.4%，中國食品藥品檢定研究院），金圣草素對照品（批號：0209-RD-0032，含量90.8%，廣州佳途科技股份有限公司）。乙腈為色譜純，甲醇、磷酸分別為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。仙桃草藥材購自市場，編號為S1～S13，共計13批，其中6批購自亳州市云興中藥科技有限公司，7批購自河北弘森藥業(yè)有限公司，經濱州醫(yī)學院林鶯副教授鑒定為玄參科植物蚊母草（Veronica peregrina L.）帶蟲癭的干燥全草。

2 方法與結果

2.1 芹菜素的確認 從初期研究發(fā)現該色譜峰與芹菜素對照品保留時間及最大紫外吸收均一致，初步判定為芹菜素。由于芹菜素具有較強的酸性，易失去氫質子形成負離子被檢測，靈敏度更高［6］。因此，為進一步驗證該色譜峰為芹菜素，選用HPLC-MS法進行確認。采用三重四極桿質譜檢測器，電噴霧離子化（ESI）負離子模式下多反應監(jiān)測（MRM），監(jiān)測離子對為m/z 268.99→117.05、m/z 268.99→107.05、m/z 268.99→151.05，以甲醇為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫：0～10 min，A：60%→40%，B：40%→60%，流速為每分鐘0.3 mL。結果如圖1、圖2所示。

從圖中可以看出，芹菜素對照品和供試品色譜總離子流（TIC）完全一致，以質荷比（m/z）268.99→117.05、m/z 268.99→107.05和m/z 268.99→151.05離子對提取的供試品離子流色譜中，同時呈現與芹菜素對照品色譜保留時間一致的色譜峰。因此可以判定，該色譜峰為芹菜素。

2.2 檢測波長的選擇 分別取木犀草素、芹菜素、金圣草素對照品，分別加甲醇制成濃度為40 μg/mL的對照品溶液，以甲醇為空白，采用紫外-可見分光光度計在200～400 nm對3個成分進行光譜掃描，確定木犀草素的最大吸收波長為350 nm和254 nm，芹菜素的最大吸收波長為337 nm和267 nm，金圣草素的最大吸收波長為348 nm和268 nm。從紫外吸收譜圖看，最大吸收波長±2 nm時吸光度差異不大，因此，確定木犀草素、金圣草素的測定波長為350 nm，芹菜素測定波長為337 nm。譜圖如圖3所示。

2.3 色譜條件 納譜ChromeCore C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（23：77）為流動相，流速1 mL/min，檢測波長木犀草素、金圣草素為350 nm，芹菜素為337 nm，柱溫35 ℃，進樣體積10 μL。

2.4 對照品溶液的制備 精密稱取木犀草素對照品18.37 mg、芹菜素對照品18.91 mg、金圣草素對照品16.86 mg，分別置25 mL、50 mL、50 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解，定容至刻度，搖勻；分別精密量取上述3種對照品溶液各1 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 供試品溶液的制備 取本品適量，粉碎使其通過三號篩，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，定容至10 mL，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6 系統(tǒng)適用性試驗 取對照品溶液及供試品溶液，按“2.3色譜條件”項下的條件進樣并記錄色譜圖。結果，待測組分色譜峰形較好，與其他組分分離度良好，理論板數以木犀草素計為23525，分離度分別為22.760、6.331、1.712。色譜圖如圖4、圖5所示。

2.7 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積積分值，分別以木犀草素、芹菜素、金圣草素對照品進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程。木犀草素線性回歸方程為Y=4100066X+16538，相關系數r=1.0000；芹菜素線性回歸方程為Y=4046730X+23355，相關系數r=0.9996；金圣草素線性回歸方程為Y=3298116X+15860，相關系數r=0.9998。結果表明，木犀草素、芹菜素、金圣草素進樣量分別在0.147～2.940 μg、0.0376～0.752 μg、0.0429～0.858 μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.8 儀器精密度考察 取混合對照品溶液，進樣5 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積積分值，結果木犀草素、芹菜素、金圣草素峰面積積分值相對平均偏差（RSD）分別為0.56%、0.75%、0.66%，結果表明儀器精密度良好。

2.9 重復性試驗 取本品適量，粉碎使其通過三號篩，取約2 g，照“2.5供試品溶液的制備”項下方法，平行制備供試品溶液6份，注入液相色譜儀，計算供試品中木犀草素、芹菜素、金圣草素的含量。結果木犀草素含量平均值為0.6348 mg/g，RSD為0.37%；芹菜素含量平均值為0.2336 mg/g，RSD為0.74%；金圣草素含量平均值為0.2000 mg/g，RSD為0.63%。結果表明，該方法重現性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗 取本品適量，粉碎使其通過三號篩，取約2 g，照“2.5供試品溶液的制備”項下方法制備供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h進樣，測定峰面積積分值，計算RSD值，結果木犀草素為1.09%、芹菜素為0.78%、金圣草素為0.82%。結果表明，供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

2.11 加樣回收率試驗 取已知含量的仙桃草樣品，精密稱取6份，每份取約1 g，分別加入木犀草素、芹菜素、金圣草素對照品溶液適量，再加入甲醇使其總體積為50 mL，稱定重量，自“加熱回流2 h”起，照“2.5供試品溶液的制備”方法同法制成回收率試驗用供試品溶液，進樣測定，計算回收率，仙桃草種木犀草素、芹菜素、金圣草素的平均回收率分別為97.79%、98.77%、97.28%，RSD值分別為0.94%、0.91%、0.77%，回收率良好。結果見表1。

2.12 樣品含量測定 采用已建立的方法對收集的13批仙桃草樣品進行測定，分別計算其中木犀草素、芹菜素和金圣草素的含量，結果見表2。結果13批仙桃草樣品的木犀草素含量在0.0391～0.7979 mg/g之間，平均值為0.5503 mg/g；芹菜素含量在0.0556～0.2655 mg/g，平均值為0.1938 mg/g；金圣草素含量在0.0575～0.2484 mg/g，平均值為0.1711 mg/g。13批樣品中有1批樣品的3個待測成分含量均遠低于其他批次，提示藥材市場上流通的不同批次仙桃草的化學成分含量存在較大差異，可能與不同產地的氣候、環(huán)境、土壤等因素有關。

3 討論

3.1 流動相的選擇 本研究比較了甲醇、乙腈與水、0.1%磷酸溶液、0.1%冰醋酸溶液不同比例的流動相系統(tǒng)，結果以乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)分離效果最佳，通過系統(tǒng)耐用性試驗考察最終確定流動相比例為乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）。

3.2 色譜柱及儀器耐用性考察 本研究分別比較了Sepax HP-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）、納譜ChromeCore C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）和依利特 Hypersil BDS C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）對仙桃草藥材種3中待測成分的分離效果，結果3種色譜柱均能對待測成分進行有效分離。同時考察了島津LC-2030C 3D Plus和沃特世2695兩種液相色譜儀的分離情況，結果均能呈現良好的分離效果。

3.3 提取溶劑和方法的選擇 本研究考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇6種提取溶劑，超聲、回流2種提取方式，0.5 h、1 h、1.5 h、2 h等4種提取時間，料液比 1∶10、1∶20、1∶25、1∶50 4種料液比，結果顯示以甲醇作為溶劑，回流提取1 h效果最佳，為保證樣品的取樣均勻性又能節(jié)約資源，確定樣品取樣量為2.0 g，提取溶劑為50 mL。

綜上，黃酮類化合物是中藥材中重要的生物活性物質，仙桃草所含黃酮類化合物可作為評價其質量的指標成分。本研究采用HPLC雙波長切換法同時測定仙桃草中木犀草素、芹菜素和金圣草素3種黃酮類成分的含量，確認了仙桃草中芹菜素的存在，可為仙桃草質量控制提供參考依據。

參考文獻

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（收稿日期：2022-08-23 編輯：劉 斌）