杜洪志 王先菊 王小波 陳志琳 李瑋

【摘 要】 目的：優(yōu)選苗藥萵比苷（商陸）總多糖的最佳提取工藝。方法：以萵比苷（商陸）為材料，以總多糖含量為指標(biāo)，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，通過(guò)單因素試驗(yàn)及L9（33） 正交試驗(yàn)相結(jié)合，研究提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比對(duì)萵比苷（商陸）中總多糖含量的影響。結(jié)果：萵比苷（商陸）最佳提取工藝為：以蒸餾水為溶劑，超聲提取60 min，料液比為1∶40（0.5 g：20 mL），提取1次。結(jié)論：通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝方法可行、重復(fù)性好、總多糖提取率高，對(duì)萵比苷（商陸）質(zhì)量評(píng)價(jià)及篩選關(guān)鍵有效部位提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 苗藥萵比苷（商陸）；正交試驗(yàn)；總多糖；提取工藝

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.2? ?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A? ? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）08-0034-05

Abstract：Objective To optimize the extraction condition of total polysaccharide of Miao Medicine Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix） by orthogonal experiment.Methods Taking Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix） as experiment materials， and the total polysaccharide were investigated， according to the single factor experiment，L9（33）orthogonal experiment and UV-Vis spectrophotometry， to study the effects of extraction time，extraction times， solid-liquid ratio on the content of total polysaccharide of Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix）. Results The optimum extraction condition of Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix） has been established as follows： distilled water as solvent， ultrasonic extraction for 60 min， solid-liquid ratio of 1∶40 （0.5 g∶20 mL）， extraction for 1 time.Conclusion The optimized extraction method by orthogonal test is feasible， reproducible and has high extraction rate of total polysaccharide， which provides a reference for quality evaluation and screening of the key effective parts of Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix）.

Key words：Miao Medicine Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix）; Total Polysaccharide; Orthogonal Experiment; Optimum Extraction Condition

苗藥萵比苷（商陸）為商陸科植物商陸Phytoluacca acinosa Roxb.或垂序商陸Phytolacca americana L.的干燥根。其生品性冷，味苦，屬冷藥，入熱經(jīng)，有毒。具有洼沃（瀉水）、達(dá)洼渥（利尿）、泱安（消腫）之功，主用于普嘎秋（水臌?。徯悴迹ㄆつw濕疹）等病癥［1］。

萵比苷（商陸）主要含有三萜皂苷類(lèi)［2］、黃酮類(lèi)［3］、多糖類(lèi)［4］等化學(xué)成分，具有利尿［5］、抗菌消炎［6］、抗肝損傷［7］等藥理作用。其中多糖類(lèi)主要包括商陸多糖Ⅰ、商陸多糖Ⅱ兩種酸性雜多糖，其結(jié)構(gòu)主要為α-（1-4）相連的多聚半乳糖醛酸［8］。有研究［9-10］報(bào)道商陸多糖能顯著增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞DNA多聚酶α活性及誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞的増殖，増強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和LAK細(xì)胞的殺瘤活性，表明該藥材中多糖類(lèi)物質(zhì)具有較好的研究?jī)r(jià)值。為了獲得較高的總多糖提取率，其提取工藝的優(yōu)選成為首要解決的關(guān)鍵問(wèn)題，以期為研究多糖類(lèi)物質(zhì)的生物活性及質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定前期基礎(chǔ)。

有研究［11］報(bào)道，采用響應(yīng)面法研究商陸總多糖的提取工藝，然其僅考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度三個(gè)因素，且提取時(shí)間較長(zhǎng)。未對(duì)乙醇除雜條件、總多糖提取方法、提取次數(shù)以及顯色條件等進(jìn)行優(yōu)化?；诖?，為了有效提取苗藥萵比苷（商陸）中總多糖，為后期篩選關(guān)鍵有效部位及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供重要參考。本文以總多糖含量為指標(biāo)，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，通過(guò)單因素試驗(yàn)及L9（33）正交試驗(yàn)相結(jié)合，研究提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比對(duì)萵比苷（商陸）中總多糖含量的影響。并對(duì)其顯色條件進(jìn)行優(yōu)選。旨在為該民族藥資源的合理開(kāi)發(fā)利用奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；ME204E型萬(wàn)分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展公司）；HS10260D型超聲清洗儀（上海易凈超聲波儀器有限公司）；101-3AB型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰士特儀器有限公司）；XL-02A型粉碎機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥 苯酚（成都市科龍化工試劑廠(chǎng)，分析純）；濃硫酸（重慶川東化工有限責(zé)任公司，分析純）；無(wú)水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純）；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：GZDD-0523，純度≥98%）購(gòu)于貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司；萵比苷（商陸）藥材采自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為商陸科植物垂序商陸Phytolacca americana L.的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品約5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得0.1014 mg/mL無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取萵比苷（商陸）樣品粉末（二號(hào)篩）0.5 g，置于100 mL錐形瓶中，加入60 mL無(wú)水乙醇，回流提取1次，每次0.5 h，趁熱過(guò)濾。用無(wú)水乙醇洗滌殘?jiān)?次，每次10 mL，棄濾液，殘?jiān)鼡]盡乙醇，將殘?jiān)蜑V紙放入100 mL錐形瓶中，精密加入20 mL蒸餾水，稱(chēng)重，超聲提取（功率300 W，50 kHz）1 h，補(bǔ)重，過(guò)濾，精密吸取續(xù)濾液1 mL置于100 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 顯色條件 精密量取1 mL待測(cè)溶液，置于10 mL具塞試管中，加5%苯酚溶液1.6 mL、濃H2SO4 7 mL，充分搖勻。沸水浴5 min，冰水浴15 min。在最大吸收波長(zhǎng)488 nm測(cè)定吸光度，以干燥品計(jì)算含量。

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液和“2.1.2”項(xiàng)樣品溶液各1 mL，按“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色，于200～800 nm之間全波長(zhǎng)掃描，記錄最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果對(duì)照品和樣品溶液在488 nm處均有最大吸收，故選取488 nm作為總多糖含量檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液2 μL、3 μL、4 μL、6 μL、7 μL、8 μL，分別置于10 μL量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，按“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色和測(cè)定吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度X為橫坐標(biāo)，得線(xiàn)性回歸方程為：Y=8.682X-0.0073（R2=0.9999），結(jié)果表明在0.02028～0.08112 mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色和測(cè)定吸光度，結(jié)果吸光度RSD值為0.63%，小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)同一樣品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色，分別于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后測(cè)定吸光度，結(jié)果吸光度RSD值為0.50%，小于3%，表明樣品在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)平行制備6份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色和測(cè)定吸光度，按“2.2.1”項(xiàng)線(xiàn)性回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果總多糖平均含量為8.82%，RSD值為2.32%，小于3%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 根據(jù)“2.2.4”項(xiàng)計(jì)算總多糖含量，減半稱(chēng)取6份樣品，每份0.25 g，精密稱(chēng)定，分別加入等量無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色和測(cè)定吸光度，按“2.2.1”項(xiàng)線(xiàn)性回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果總多糖加樣回收率平均值為103.89%，RSD值為2.39%，小于3%，表明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.3 提取工藝優(yōu)選

2.3.1 單因素試驗(yàn) 以乙醇為溶劑，分別進(jìn)行除雜時(shí)間、乙醇濃度的單因素試驗(yàn)考察；再以蒸餾水為溶劑，分別進(jìn)行提取方法、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比的單因素試驗(yàn)考察，不同因素不同水平均平行3份樣，按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行總多糖的含量測(cè)定。①乙醇除雜時(shí)間：30 min、60 min、90 min；②乙醇除雜濃度：100%、95%、90%、85%乙醇；③提取方法：超聲提取、回流提?。虎芴崛r(shí)間：10 min、20 min、40 min、60 min、80 min；⑤提取次數(shù)：1次、2次、3次；⑥料液比：1∶10（0.5 g∶5 mL），1∶20（0.5 g∶10 mL），1∶30（0.5 g∶15 mL），1∶40（0.5 g∶20 mL），1∶50（0.5 g∶25 mL）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，萵比苷（商陸）總多糖單因素最佳提取工藝為：精密稱(chēng)取原藥材0.5 g，加無(wú)水乙醇回流提取30 min，過(guò)濾，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇清洗兩次后揮盡乙醇，將殘?jiān)蜑V紙放入100 mL錐形瓶中，以蒸餾水為溶劑，超聲提取60 min，提取2次，料液比為1∶30（0.5 g∶15 mL）。研究結(jié)果如圖1所示。

2.3.2 顯色條件的優(yōu)選 分別進(jìn)行顯色劑加入量考察，熱浴、冷浴時(shí)間的考察，不同因素不同水平均平行3份樣，按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行總多糖的含量測(cè)定。①5%苯酚和濃硫酸用量（mL/mL）：0.5∶2，1.5∶6，1.6∶7、2.0∶8；②熱浴、冷浴時(shí)間（min/min）：5∶15，10∶10，15∶5。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，萵比苷（商陸）最佳顯色條件為：取稀釋溶液1 mL，加5%苯酚溶液1.6 mL、濃H2SO4 7 mL，充分搖勻，沸水浴5 min，冰水浴15 min。在最大吸收波長(zhǎng)488 nm測(cè)定吸光度，研究結(jié)果如圖2所示。

2.3.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)考察 根據(jù)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，選擇提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)選最佳提取工藝，每個(gè)因素設(shè)計(jì)三個(gè)水平，選用L9（33）進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)進(jìn)行顯色和測(cè)定吸光度，按“2.2.1”項(xiàng)回歸方程計(jì)算總多糖含量。結(jié)果正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀(guān)分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由表2、表3可知，極差C＞D＞A＞B，極差A(yù)＞B＞C，由此可見(jiàn)，對(duì)萵比苷（商陸）多糖含量影響較大的因素依次為提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞料液比。且提取時(shí)間具有顯著性差異，因此選擇A2。而提取次數(shù)、料液比均無(wú)顯著性差異，因提取次數(shù)較多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且操作步驟繁瑣，誤差較大，故提取次數(shù)選擇1次進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)；料液比結(jié)合均值，選擇1∶40（0.5 g∶20 mL）。

綜上，萵比苷（商陸）總多糖最佳提取工藝為A2B1C3，即：精密稱(chēng)取樣品粉末（二號(hào)篩）0.5 g，置于100 mL錐形瓶中，加60 mL無(wú)水乙醇回流提取0.5 h，趁熱過(guò)濾。殘?jiān)脽o(wú)水乙醇洗滌2次，每次10 mL。揮盡乙醇，將殘?jiān)蜑V紙置于100 mL錐形瓶中，精密加入20 mL蒸餾水，稱(chēng)重，超聲提?。üβ?00 W，50 kHz）1次，每次1 h，補(bǔ)重，過(guò)濾，精密吸取續(xù)濾液1 mL置于10 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻即得。

2.4 正交驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱(chēng)取萵比苷（商陸）藥材粉末（二號(hào)篩），平行3份樣，每份約0.5 g，根據(jù)正交試驗(yàn)考察的結(jié)果制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)進(jìn)行顯色和測(cè)定吸光度，按“2.2.1”項(xiàng)回歸方程計(jì)算總多糖含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

按正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳提取工藝提取總多糖，結(jié)果平均百分含量為8.77%， RSD<3%，高于正交試驗(yàn)中各項(xiàng)結(jié)果，表明最佳提取工藝條件穩(wěn)定，重復(fù)性好，總多糖提取率較高。

3 小結(jié)和討論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交優(yōu)化試驗(yàn)，考察了不同因素不同水平對(duì)苗藥萵比苷（商陸）中總多糖含量的影響，結(jié)果以提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比為主要影響因素，設(shè)計(jì)L9（33）三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)選了最佳提取工藝，并對(duì)該工藝進(jìn)行了方法驗(yàn)證。同時(shí)，對(duì)顯色條件進(jìn)行了考察，進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)方法。研究結(jié)果表明提取工藝方法可行、重復(fù)性好、總多糖提取率較高，為萵比苷（商陸）質(zhì)量評(píng)價(jià)及篩選關(guān)鍵有效部位提供參考依據(jù)。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，提取次數(shù)以3次為宜，然通過(guò)方差分析提取次數(shù)之間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，若進(jìn)行中試或藥效學(xué)試驗(yàn)篩選有效部位時(shí)，因藥材用量較大，可提取2～3次，合并回收濾液，以期獲得高效、經(jīng)濟(jì)的目的；若進(jìn)行樣品含量測(cè)定質(zhì)量控制分析時(shí)，可提取1次，以期減少實(shí)驗(yàn)操作誤差。

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（收稿日期：2022-08-08 編輯：劉 斌）