楊希川

（山東省臨沭縣動物疫病預防控制中心，山東臨沂 276700）

病毒樣顆粒（VLPs）是一種空心顆粒，由病毒結(jié)構(gòu)蛋白自動組合而成，結(jié)構(gòu)蛋白可以是1 個或多個，在形態(tài)上與天然病毒粒子相似，被稱為“假病毒”或“偽病毒”。病毒樣顆粒雖然具有較強的免疫原性，但沒有傳染性，其主要通過與病毒感染一致的途徑呈遞到T、B淋巴細胞群體中，從而對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護反應進行誘導[1]?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外針對動物的病毒性疾病，至少研發(fā)了35 種病毒樣顆粒疫苗進行預防。豬傳染性疾病種類較多，對生豬養(yǎng)殖產(chǎn)生了嚴重的影響，科學防控豬傳染性疾病是穩(wěn)定養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要任務。疫苗是防控動物疾病的最佳方法，但是也會產(chǎn)生一定的副作用，如疫苗所選用輔料溶劑的純度、安全性及弱毒疫苗的返強風險等。因此，科研人員需要對疫苗研發(fā)多加關注，為研發(fā)更多安全的疫苗而努力。近年來，隨著DNA 應用技術的不斷發(fā)展和基因工程技術的進步，用于豬病防控的新型疫苗數(shù)量逐漸增多，病毒樣顆粒疫苗也逐漸受到關注。本文以幾種常見的豬病為切入點，對病毒樣顆粒疫苗在豬病防控中的應用進展加以分析，為養(yǎng)豬企業(yè)在疫苗選擇方面提供參考。

1 病毒樣顆粒及其表達系統(tǒng)

病毒樣顆粒是由一種或多種組織蛋白、衣殼蛋白通過自我組裝而成的，具有特定空間構(gòu)象的空心顆粒，直徑約為20～150 nm，不含遺傳物質(zhì)和病毒核酸，既不能自主復制，也不具有感染力，但是該空間結(jié)構(gòu)和形態(tài)與活病毒極其相似，具有納米材料特性[2]。根據(jù)病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)，可將其分為2 類，一類是無囊膜病毒樣顆粒，一類是有囊膜病毒樣顆粒。無囊膜病毒樣顆粒不含宿主成分，主要是由病毒衣殼蛋白自我組裝而成，如豬圓環(huán)病毒、乙肝病毒、人類乳頭狀瘤病毒的衣殼蛋白均能形成無囊膜病毒樣顆粒[3]。有囊膜病毒樣顆粒由表面宿主細胞膜、衣殼蛋白組成，其可同時對異源病原體及同源病原體的多種抗原進行整合，并從細胞膜中釋放，如丙肝病毒、流感病毒可形成有囊膜的病毒樣顆粒。病毒樣顆粒有3 個突出的優(yōu)勢：一是病毒樣顆粒以基因工程或者化學交聯(lián)等方式對自身結(jié)構(gòu)進行修飾（或改造）；二是病毒樣顆粒能夠?qū)怂岱肿樱姾蓴?shù)量適中）、非核酸分子及分子質(zhì)量進行包裹；三是部分病毒的病毒樣顆?？煞謩e在原核表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)中進行自我組裝。上述優(yōu)勢的發(fā)現(xiàn)，為病毒樣顆粒疫苗的研發(fā)提供一定支持?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實，病毒樣顆粒在制備過程中，表達系統(tǒng)的選擇對其產(chǎn)生深遠影響，在不同表達系統(tǒng)中，衣殼蛋白特性存在較大差異，因此，對其組裝和折疊產(chǎn)生一定影響[4]。自20 世紀80 年代開始，病毒樣顆粒抗原表達中已經(jīng)廣泛使用了多種表達系統(tǒng)，在已經(jīng)成功表達的病毒樣顆粒中，植物類、哺乳動物類、酵母類、昆蟲細胞類、細菌類等的病毒樣顆粒占比分別為9%、15%、20%、28%、28%。

2 病毒樣顆粒疫苗在豬病防控中的應用

2.1 對豬圓環(huán)病毒病的防控研究

在豬圓環(huán)病毒病中，2 型豬圓環(huán)病毒（PCV2）是引起6～12 周齡仔豬PMWS 的典型病原。目前，PCV2 的感染嚴重危害生豬健康，對產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成不良影響。趙曉云等[5]根據(jù)PCV2 ORF2 基因的編碼特點，發(fā)現(xiàn)PCV2免疫原性蛋白Cap 能夠在體外自我合成病毒樣顆粒，結(jié)合SUMO 表達技術，首次體外制備成Cap 蛋白病毒樣顆粒，為豬圓環(huán)病毒病病毒樣顆粒疫苗的研制奠定了基礎，并且通過其他學者的驗證表明，PCV2 病毒樣顆粒疫苗能夠?qū)C體細胞免疫反應產(chǎn)生刺激作用，并且具有刺激機體體液產(chǎn)生免疫反應的功能[6]。徐 嫄等[7]研究發(fā)現(xiàn)，采用Bac-to-Bac 桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)，能夠獲得PCV2b 重組桿狀病毒，其感染HighFiveTM 細胞后，在細胞培養(yǎng)中檢測到相關蛋白，并且自動組裝成病毒樣顆粒，直徑在15～17 nm，此研究從側(cè)面證實細胞培養(yǎng)液的上清液中存在大量病毒樣顆粒，為目的蛋白純化處理及疫苗研制提供了理論基礎。王宇[8]研究發(fā)現(xiàn)，在無免疫佐劑的遷移下，用帶有2 型豬圓環(huán)病毒抗原表位的豬細小病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠，不僅能夠誘導小鼠機體產(chǎn)生2 型豬圓環(huán)病毒特異性的CTLA 反應，還能使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生豬細小病毒特異性抗體，并且這種抗體是高效價的。何至遠等[9]研究證實，將2 型豬圓環(huán)病毒ORF2 蛋白插入豬細小病毒VP2 蛋白的2 個位點，形成了2 個重組體，該重組體對病毒樣顆粒疫苗位點的形成并不產(chǎn)生影響，且具有較好的免疫原性，為病毒樣顆粒多價疫苗研制找到理論根據(jù)。

2.2 對豬細小病毒病的防控研究

Cartwright 首次在流產(chǎn)母豬體內(nèi)分離到豬細小病毒，其基因組內(nèi)包含ORF，且從進化角度看，豬細小病毒NS 序列相對保守，編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白在豬細小病毒DNA 復制上發(fā)揮一定作用[10]。普遍認為，引發(fā)母豬繁殖障礙的主要病原就是豬細小病毒，感染此病毒后，可引起胚胎及胎兒死亡，增加母豬流產(chǎn)風險[11]。對于豬細小病毒，傳統(tǒng)疫苗以滅活疫苗為主，也包括弱毒苗，如NADL-2 弱毒株疫苗。國外學者Paul 等人收集豬細小病毒強毒株，并對其進行了50 余次的細胞連續(xù)傳代，獲得用于制備弱毒苗的豬細小病毒弱毒株，最終發(fā)現(xiàn)經(jīng)口鼻為母豬接種弱毒苗后，致弱的豬細小病毒無法直接經(jīng)過胎盤感染胎兒；而經(jīng)子宮內(nèi)接種致弱的豬細小病毒，則可對胎兒造成感染，甚至引發(fā)胎兒死亡，這也導致弱毒苗的應用被限制在非妊娠母豬中[12]。豬細小病毒基因組編碼中共包含VP1、VP2、VP3 等3 種結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP2 具有中和抗體的功能，是構(gòu)成病毒粒子的主要靶蛋白（衣殼蛋白），豬細小病毒VP2 結(jié)構(gòu)蛋白基因免疫原性良好，可在哺乳動物桿狀病毒表達系統(tǒng)中進行體外表達，從而形成病毒樣顆粒，對中和抗體的生成起到誘導作用，具有高穩(wěn)定性，可替代傳統(tǒng)的豬細小病毒病疫苗[13]。根據(jù)上述研究結(jié)果，陸續(xù)又有多位學者將豬細小病毒VP2 基因克隆到桿狀病毒表達系統(tǒng)中，經(jīng)蛋白質(zhì)表達結(jié)果顯示，成功獲取了豬細小病毒類病毒粒子，并誘導產(chǎn)生抗體[14]。還有學者將豬細小病毒VP2 基因成功在酵母表達系統(tǒng)中表達，同時通過體外裝配方式形成病毒樣顆粒，經(jīng)驗證，其免疫效果良好。

2.3 對豬傳染性胃腸炎的防控研究

TGEV 是引發(fā)豬傳染性胃腸炎的主要病原，感染后可導致病豬出現(xiàn)嚴重腹瀉，同時伴有嘔吐、脫水癥狀，具有高度的傳染性，低于2 周齡的仔豬患豬傳染性胃腸后，病死率高達100%，對生豬養(yǎng)殖造成嚴重經(jīng)濟損失[15]。研究發(fā)現(xiàn)，體外共表達的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）中含有sM 蛋白和M 蛋白，可形成病毒樣顆粒，可對干擾素-α 產(chǎn)生誘導效果，對豬傳染性胃腸炎具有防御作用[16]。有學者通過家蠶BAC-to-BAC 桿狀病毒表達系統(tǒng)，成功表達了具有sM 蛋白、N 蛋白和M 蛋白的重組病毒，且病毒樣顆粒體外組裝試驗結(jié)果顯示，M 蛋白在sf9 細胞中單獨表達，且M 蛋白分別于sM 蛋白、N 蛋白共表達，均可組裝成病毒樣顆粒，但是大小不盡相同，為研究和制備預防豬傳染性胃腸炎的病毒樣顆粒疫苗提供理論依據(jù)[17]。

2.4 對豬乙型腦炎的防控研究

在眾多豬病中，豬乙型腦炎是一種人畜共患傳染病，日本腦炎病毒（JEV）是引發(fā)豬乙型腦炎的重要病原，日本腦炎病毒E 蛋白中包含ED-Ⅲ結(jié)構(gòu)，即結(jié)構(gòu)域-Ⅲ，該區(qū)域負責對中和抗體進行誘導。體外試驗結(jié)果顯示，結(jié)構(gòu)域-Ⅲ中l(wèi)oop3 環(huán)肽可對病毒感染進行有效抑制，小鼠攻毒試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，loop3 環(huán)肽能夠發(fā)揮最強保護作用[18]。秦佳儀[19]深入研究證實，在乙肝病毒（HBV）中，乙肝核心蛋白（HBC）是該蛋白的核心結(jié)構(gòu)，其不僅能夠在真核細胞中被高效表達，同時可在哺乳動物細胞、細菌中進行表達，并且自動裝配成病毒樣顆粒。試驗結(jié)果表明，在乙肝核心蛋白特定部位插入短肽序列（外源性loop3 環(huán)肽），不僅不會對乙肝核心蛋白的構(gòu)象產(chǎn)生影響，同時也不會限制其自我組裝，并且短肽能夠以多次重復形式出現(xiàn)在病毒樣顆粒的表面，使表位肽自身免疫原性得到大幅強化。因此，將loop3 環(huán)肽基因與乙肝核心蛋白基因進行重組，病毒樣顆?？梢暈槊庖咻d體，進一步強化loop3 環(huán)肽表位的免疫抗原性。通過上述研究結(jié)果，國內(nèi)學者將乙肝核心蛋白作為載體，重組HBC-loop3，經(jīng)過純化處理后，采用透射電鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)大量病毒樣顆粒，為豬乙型腦炎病毒樣顆粒疫苗的研制提供了思路。

2.5 對豬瘟防控的研究

豬瘟是常見的豬急性傳染性疾病，傳播速度快，死亡率高，尤其非洲豬瘟。我國2018 年8 月在沈陽市首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫病，隨后短時間內(nèi)在我國多個省份點狀發(fā)病，導致我國生豬存欄急劇下降，對我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴重影響。

引發(fā)豬瘟的主要病原為豬瘟病毒（CSFV），該病毒主要包括多肽E290 及非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3。有研究發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒中含有的CTL 細胞表位，不僅在細胞免疫中發(fā)揮重要作用，同時對體液免疫也產(chǎn)生影響。范京惠等[20]利用共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞sf9 對桿狀病毒進行重組，并在體外進行表達，并發(fā)現(xiàn)表達的蛋白不僅具備天然蛋白的生物學特征，同時能夠自我組裝并形成病毒樣顆粒，在無免疫佐劑的基礎上對小鼠進行免疫，成功在小鼠機體內(nèi)誘導出高效價抗豬瘟病毒的特異CTL 反應，經(jīng)對比試驗證實，其抗體效應明顯比滅活疫苗要高。Kurtovic 等[21]用乳酸菌表達了豬瘟病毒CTL 細胞表位，成功誘導出豬黏膜免疫反應，可幫助生豬抵抗致死劑量豬瘟病毒的攻擊。

2.6 對其他豬病防控的研究

病毒樣顆粒疫苗在其他豬病防控中的應用研究也有一定進展，如豬偽狂犬病、口蹄疫、豬藍耳病等[22]。如國內(nèi)研究者利用桿狀病毒表達系統(tǒng)，成功表達豬藍耳病病毒的N 蛋白、M 蛋白以及GP5、GP2b，并證實M 蛋白與GP5 共表達可組裝成病毒樣顆粒，且GP2b 在其中發(fā)揮幫助病毒樣顆粒釋放的作用[23]。

3 小結(jié)

綜上所述，病毒樣顆粒疫苗免疫優(yōu)勢明顯，不僅容易被免疫系統(tǒng)識別，并且因其無法自主復制、不含核酸，在血清中的半衰期較長，可發(fā)揮良好的免疫效果，將有助于病毒慢性感染及腫瘤所帶來的免疫耐受，使病毒樣顆粒疫苗能夠直接用于預防和治療某些動物疫病。與傳統(tǒng)疫苗相比，病毒樣顆粒疫苗有效彌補了基因工程疫苗安全性方面的缺陷，是動物最具發(fā)展前景的候選疫苗之一，在豬病防控方面有良好且廣闊的應用前景，未來需要加強病毒樣顆粒的劑量與佐劑比例的研究，并且根據(jù)不同豬病確定最佳疫苗使用劑量及免疫途徑。隨著對病毒樣顆粒研究的不斷深入，病毒樣顆粒疫苗的制備問題也將得到解決，屆時將有更多的病毒樣顆粒疫苗問世，為生豬疫病防控提供更多支持。