李文正，劉文靜，曹妍，李瑋，趙晨，劉叢盛*，宋青青*，宋月林

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100248；

2.漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，福建 漳州 363000

片仔癀是國家一級中藥保護(hù)品種，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，片仔癀具有抗炎、抗腫瘤、保肝等多種作用[2-5]，臨床應(yīng)用廣泛。目前已公開的藥味包括植物藥三七，以及天然麝香、蛇膽和牛黃3 味名貴動物藥[4]，其中三七皂苷、麝香酮、膽汁酸等小分子化合物已被深入研究，并作為片仔癀質(zhì)量標(biāo)志物用于其質(zhì)量評價[6-10]。蛋白、多肽等大分子化合物雖也表現(xiàn)出廣泛的藥理活性，如麝香多肽具有抗炎、抗癌的作用[11-12]，三七中含有抗真菌蛋白[13]，但未對其進(jìn)行深入分析和研究。

鳥槍法蛋白組學(xué)通過酶解樣品中的蛋白，采用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）對肽段進(jìn)行分離鑒定，從而實現(xiàn)蛋白的全譜分析。該策略能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜樣品中蛋白高通量的定性、定量分析[14]，尤其適用于富含大量蛋白的動物類中藥的分析。但基于該平臺的多肽定量分析靈敏度較差、動態(tài)線性范圍窄，難以滿足樣品中種類多且含量差異大的蛋白的全面精準(zhǔn)定量分析。三重四極桿（QqQ）-MS 的選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）被視為絕對定量的金標(biāo)準(zhǔn)[15]，前后2 個四極桿（Q1、Q3）作為質(zhì)量過濾器，中間四級桿（Q2）作為碰撞池發(fā)生碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生碎片離子，設(shè)定前體離子和碎片離子分別通過Q1和Q3可以增強選擇性，提高靈敏度，定量線性范圍更是增加到5 個數(shù)量級[15]。然而，SRM 建立的關(guān)鍵在于獲得被測物的最佳質(zhì)譜參數(shù)。Skyline 軟件能夠預(yù)測SRM 參數(shù)[16]，但受不同分析儀器的限制，其推薦的SRM 參數(shù)并不能使所有QqQ-MS 發(fā)揮定量優(yōu)勢。本課題組前期建立了在線能量分辨（online ER）-MS，可以在各種QqQ-MS 平臺實現(xiàn)不依賴于對照品的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化[17-18]，提高了方法的靈敏度，擴寬了線性范圍。

本研究基于鳥槍法蛋白組學(xué)策略，利用nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS 結(jié)合UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）分析并鑒定片仔癀中蛋白類成分，篩選特征肽，采用online ER-MS 優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，建立反相液相色譜（RPLC）-SRM 定量分析方法，測定了11 批片仔癀中的3 個胰酶水解特征肽含量，可為片仔癀的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ME204 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；5424R 型離心機（德國艾本德公司）；MQD-S2P 型恒溫雙層搖床（上海旻泉儀器有限公司）；UltiMate 3000 型納升級超高效液相色譜系統(tǒng)、Q Exactive HF 型質(zhì)譜儀（美國賽默飛公司）；LC-20ADXR 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Qtrap 5500 型質(zhì)譜儀（美國Sciex 公司）；10 kDa 超濾管（美國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

二辛可寧酸（BCA）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；三氯乙基磷酸酯（TCEP，北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；碘代乙酰胺（美國Sigma 公司）；比伐盧定（上海源葉生物科技有限公司）；胰蛋白酶（美國普洛麥格公司）；碳酸氫銨和尿素（北京化工廠）；質(zhì)譜級甲酸和乙腈（美國賽默飛公司）；超純水由實驗室Milli-Q 型純水系統(tǒng)制備；多肽ALSSALHER、TLLEGEESR、VAPLGEEFR 由上海源葉生物科技有限公司合成（純度≥98%）。

各批片仔癀由漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司提供（表1），樣品存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥現(xiàn)代研究中心。

表1 11批片仔癀樣品信息及其總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

1.3 混合對照品溶液制備

分別取多肽對照品ALSSALHER、TLLEGEESR、VAPLGEEFR 適量，精密稱定，用純水溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL–1的儲備液。精密吸取各對照品儲備液，用純水制備成終質(zhì)量濃度均為10 μg·mL–1的混合對照品溶液，用純水逐級稀釋，得到系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，待用。

取比伐盧定適量，精密稱定，用純水配成質(zhì)量濃度為1 mg·mL–1的內(nèi)標(biāo)（IS）儲備液，稀釋至質(zhì)量濃度為100 μg·mL–1，待用。

精密吸取各對照品溶液50 μL，分別加入等體積的內(nèi)標(biāo)溶液，得到系列質(zhì)量濃度的含內(nèi)標(biāo)的混合對照品溶液。

1.4 供試品溶液制備

精密稱定各批片仔癀50 mg，分別加入甲醇1 mL，超聲提取30 min，在4 °C、7607×g離心10 min，去上清液；加入50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液1 mL，超聲提取30 min，7607×g離心，取上清液，重復(fù)操作，合并上清液至4 mL 離心管，冷凍干燥16 h，加入純水200 μL 復(fù)溶，得到片仔癀總蛋白溶液，BCA法測定總蛋白濃度。隨后，采用過濾輔助提取法制備片仔癀多肽樣品。取一定體積的片仔癀總蛋白溶液（蛋白質(zhì)量為2.5 mg），在95 °C 加熱5 min，放至室溫，加入TCEP，尿素補足至300 μL使TCEP終濃度為10 mmol·L–1，在67 °C 加熱10 min，然后放至室溫。將樣品轉(zhuǎn)移至10 kDa超濾管，15 871×g離心30 min后加入100 mmol·L–1碘乙酰胺溶液100 μL，避光反應(yīng)30 min，加入8 mmol·L–1尿素100 μL，15 871×g離心30 min；加入50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液200 μL，15 871×g離心30 min，重復(fù)2次，棄去超濾液；在超濾管中加入胰蛋白酶（胰酶∶蛋白為1∶50），于37 °C、200 r·min–1的搖床中酶解16 h，更換離心管，離心收集超濾液，加入水100 μL，再次離心，收集超濾液，合并2 次超濾液，冷凍干燥，加入純水100 μL復(fù)溶，得到片仔癀酶解多肽樣品。吸取上述酶解樣品50 μL，加入等體積內(nèi)標(biāo)溶液，即得供試品溶液。

1.5 Nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS分析

采用nano LC-Q Exactive HF Orbitrap MS 系統(tǒng)，分析片仔癀酶解多肽樣品。EASY-SprayTM色譜柱（100 mm×0.75 mm，3 μm，美國賽默飛公司）；進(jìn)樣量為2 μL；流動相為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～5.0 min，5%～8%B；5.0～68.0 min，8%～35%B；68.0～75.0 min，35%～50%B；75.0～80.0 min，50%～100%B；80.0～85.0 min，100%B；85.0～85.1 min，100%～5%B；85.1～90.0 min，5%B）；柱溫為60 °C；流速為0.5 μL·min–1。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能（CE）為35%，活化時間為10 ms，MS1全掃描范圍m/z350～1500，分辨率為60 000；MS2譜圖以FTMS模式采集，掃描范圍m/z120～1970，分辨率為7500。

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MaxQuant 1.6.10，使用Andromeda 肽段搜索引擎及UniProt 數(shù)據(jù)庫檢索，參數(shù)設(shè)置如下：蛋白和多肽假陽性率（FDR）≤1%；酶解方式為胰蛋白酶酶切（Trypsin）/P；酶切遺漏數(shù)為2；固定修飾為半胱氨酸烷基化；可變修飾為甲硫氨酸的氧化和蛋白N端乙?；?。

1.6 基于RPLC-SRM的片仔癀特征肽定量分析

采用LC-Qtrap MS/MS系統(tǒng)對片仔癀酶解多肽樣品中3 個特征肽進(jìn)行定量分析。色譜柱為HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Waters 公司）；柱溫為40 °C；流速為0.2 mL·min–1；進(jìn)樣量為5 μL；流動相為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗 脫（0～2.00 min，12%～15%B；2.00～3.00 min，15%～30%B；3.00～6.00 min，30%～35%B；6.00～7.00 min，35%～55%B；7.01～12.00 min，12%B）。質(zhì)譜檢測采用ESI正離子模式，離子源參數(shù)：氣簾氣（CUR）為35 psi（1 psi≈6.895 kPa），碰撞氣（CAD）為High，噴霧電壓為5500 V，溫度（TEM）為450 °C，離子源氣體1（GS1）為55 psi，GS2為55 psi。

采用online ER-MS 對3 個特征肽離子對的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，首先將高分辨質(zhì)譜采集得到的前體離子與MS2中響應(yīng)高的子離子配對，進(jìn)而派生出一系列擬離子對（PITs），給予PITs 階梯式CE，通過擬合裂解曲線獲得最佳碰撞能（OCE）。以VAPLGEEFR 為例，其前體離子[M+2H]2+m/z為509.29，MS2中主要碎片離子m/z為847.43（y7+）、750.38（y6+）、637.30（y5+）、424.22（y72+），構(gòu)建4對候選離子對m/z509.3→847.4、509.3→750.4、509.3→637.3、509.3→424.2，進(jìn)而衍生出4 組PITs，如m/z509.3→847.4 可以衍生出1 組PITs 509.290→847.401、509.290→847.402、509.290→847.403等，以2 eV為步長，每個PIT掃描時間為5 ms，采集CE 為6～50 eV 的峰面積。峰面積經(jīng)歸一化處理后，導(dǎo)入GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行高斯曲線擬合，獲得各離子對裂解曲線，曲線頂點對應(yīng)的CE 即為OCE。VAPLGEEFR 的其余離子對m/z509.3→750.4、509.3→637.3、509.3→424.2，特征肽ALSSALHER、TLLEGEESR 的離子對及相應(yīng)CE 均按上述方法優(yōu)化。

1.7 方法學(xué)驗證

1.7.1 線性和靈敏度 分析1.3 項下各質(zhì)量濃度混合對照品溶液，以被測成分峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積作為縱坐標(biāo)（Y），以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍。以信噪比（S/N）約為3的被測成分質(zhì)量濃度作為檢測下限（LLOD），以S/N 約為10 的被測成分質(zhì)量濃度作為定量下限（LLOQ）。

1.7.2 精密度考察 在被測成分的線性范圍內(nèi)，取高（500 ng·mL–1）、中（125 ng·mL–1）、低（31 ng·mL–1）質(zhì)量濃度進(jìn)行日內(nèi)精密度考察，每個質(zhì)量濃度連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。

1.7.3 重復(fù)性考察 按1.4 項下方法平行制備5 份供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

1.7.4 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，在4 °C保存，分別在0、2、4、8、12 h 分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積。

1.8 特征肽的含量測定

按1.4 項下方法制備11 批片仔癀供試品溶液，按1.6 項下方法建立的定量方法進(jìn)樣分析，將峰面積比值（分析物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得待測物質(zhì)量濃度，計算各批片仔癀中目標(biāo)多肽含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 總蛋白樣品制備條件的優(yōu)化

為提高片仔癀樣品總蛋白的提取率，本研究分別考察了不同提取溶液（RIPA 裂解液、水、50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液、甲醇和50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液）、料液比（1∶10、1∶20、1∶50）、提取時間（0.5、1.0、2.0 h）對提取效率的影響，通過BCA 法測定總蛋白含量。結(jié)果表明，采用50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液提取蛋白效率顯著高于RIPA 裂解液和水，同時，采用甲醇提取片仔癀樣品，棄去上清液后用50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液提取，與單獨使用50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液的蛋白提取效率近乎一致，且進(jìn)一步減少了基質(zhì)中脂溶性雜質(zhì)的干擾；料液比1∶20與1∶50提取得到的總蛋白含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均高于料液比1∶10時提取總蛋白含量；不同提取時間得到的總蛋白量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。最終，片仔癀樣品提取條件為采用料液比1∶20，先甲醇提取0.5 h 并去除上清液，沉淀用50 mmol·L–1碳酸氫銨水溶液再次提取0.5 h。BCA法測得各批片仔癀總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。

2.2 片仔癀中蛋白多肽的定性分析

高分辨nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS 采集的片仔癀酶解多肽樣品的總離子流圖見圖1。使用MaxQuant 1.6.10 軟件對采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用Andromeda 與UniProt 數(shù)據(jù)庫鑒別多肽序列，并歸屬蛋白來源。最終，從片仔癀胰酶水解多肽樣品中鑒定了343個肽段，來源于200個蛋白，以酶和骨架蛋白為主。各蛋白的氨基酸數(shù)目為18～4563，匹配肽段數(shù)為1～13，序列覆蓋率為0.33%～100.00%，鑒定得分前20 的蛋白見表2，其中16 個蛋白來源于牛，1個蛋白來源于人參。

圖1 片仔癀酶解多肽樣品的nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS總離子流圖

表2 片仔癀中鑒別得分前20的蛋白

在此基礎(chǔ)上，選擇無修飾、無漏切位點、響應(yīng)高、穩(wěn)定性好且長度適宜的特征肽ALSSALHER、TLLEGEESR 和VAPLGEEFR 進(jìn)行定量分析。ALSSALHER 來源于酶（alpha-amylase A type-1/2，P0C1B3）、TLLEGEESR 來源于骨架蛋白（keratin,type Ⅱ cytoskeletal 1，P04264）、VAPLGEEFR 來源于載脂蛋白（apolipoprotein A-I，P15497）。

2.3 RPLC-SRM定量方法的建立

2.3.1 RPLC-SRM 方法的優(yōu)化 為了實現(xiàn)RPLCSRM 對3 個特征肽定量測定，除了在色譜上對待測物的有效分離，避免其流出而造成的離子化競爭，更需要設(shè)置適宜的待測物質(zhì)譜參數(shù)，提高其質(zhì)譜響應(yīng)。雖然多肽質(zhì)譜參數(shù)可以通過Skyline 軟件預(yù)測得到，或是通過注射對照品手動優(yōu)化獲得，但不可避免會有檢測靈敏度低、多肽對照品消耗量大、優(yōu)化過程費時等缺點。Online ER-MS 策略無需對照品便能實現(xiàn)質(zhì)譜參數(shù)的精確優(yōu)化，獲得優(yōu)于Skyline 預(yù)測的質(zhì)譜參數(shù)。

以VAPLGEEFR 為例闡明CE 優(yōu)化過程。首先，通過高分辨質(zhì)譜采集到多肽VAPLGEEFR 的MS1前體離子信息[M+2H]2+m/z為509.29，MS2主要碎片離子為酰胺鍵斷裂生成的m/z918.47（y8+）、847.43（y7+）、750.38（y6+）、637.30（y5+）、580.28（y4+）、451.23（y3+）、424.22（y72+）、322.19（y2+）、268.17（b3+）、175.12（y1+）（表3，圖2），選擇其中響應(yīng)較高的碎片離子m/z為847.43、750.38、637.30、424.22，構(gòu)建4 對候選離子對m/z509.3→847.4、509.3→750.4、509.3→637.3、509.3→424.2，進(jìn)而衍生出4 組PITs（m/z509.290→847.431、509.290→847.432、509.290→847.433等，m/z509.290→750.381、509.290→750.382、509.290→750.383 等，m/z509.290→637.301、509.290→637.302、509.290→637.303 等，m/z509.290→424.221、509.290→424.222、509.290→424.223 等）。以2 eV 為步長，在CE 為6～50 eV 時，賦予每個PIT 1個CE，每個PIT掃描時間5 ms。由于Qtrap的Q1和Q3分辨率低，無法識別PITs之間50 mDa以下的差異，因此能夠采集得到同一化合物不同CE下對應(yīng)的峰面積，也能通過Analyst軟件SRM模式進(jìn)行自檢。將多肽VAPLGEEFR 4組PITs在不同能量下的峰面積進(jìn)行歸一化后導(dǎo)入GraphPad Prism 8.0 軟件，分別采用高斯曲線擬合裂解曲線，m/z509.3→847.4 的高斯曲線方程為Y=13.2×exp{–0.5[(X–23.3)/7.8]2}，OCE 為23.3 eV；m/z509.3→750.4的高斯曲線方程為Y=14.2×exp{–0.5[(X–28.9)/7.6]2}，OCE為28.9 eV；m/z509.3→637.3的高斯曲線方程為Y=30.5×exp{–0.5[(X–28.6)/7.4]2}，OCE為28.6 eV；m/z509.3→424.2 的高斯曲線方程為Y=100.9×exp{–0.5[(X–20.6)/5.0]2}，OCE為20.6 eV（圖3）。與Skyline 軟件推薦的結(jié)果相比，多肽VAPLGEEFR 4個候選離子對相同，且各離子對的CE預(yù)測值均為24.8 eV，不能達(dá)到各離子對的最佳響應(yīng)，如離子對m/z509.3→424.2在24.8 eV 時的響應(yīng)僅為在OCE（20.6 eV）時的70%，故online ER-MS能夠獲得最佳質(zhì)譜參數(shù)用于建立多肽定量方法。雖然多肽VAPLGEEFR 4 個候選離子對中m/z509.3→424.2響應(yīng)最高，但該離子對專屬性差，同時能檢測到另一色譜峰且與VAPLGEEFR 分離度差，因此為了保障分析方法的專屬性、靈敏度，最終選擇m/z509.3→637.3（28.6 eV）作為定量離子對。

圖2 片仔癀胰酶酶解樣品中特征肽VAPLGEEFR的MS2譜圖及結(jié)構(gòu)注釋

圖3 多肽VAPLGEEFR候選離子對的裂解曲線

表3 片仔癀3個特征肽多級質(zhì)譜及其定量離子對、CE信息

另2 個特征肽ALSSALHER 與TLLEGEESR 同樣采用online ER-MS 策略進(jìn)行分析，最終多肽ALSSALHER 的定量離子對為m/z492.3→799.4，高斯曲線Y=100.0×exp{–0.5[(X–25.0)/6.6]2}，OCE為25.0 eV，多肽TLLEGEESR的定量離子對為m/z517.3→819.4，高斯曲線Y=104.2×exp{–0.5[(X–24.4)/7.6]2}，OCE為24.4 eV（表3）。

將已優(yōu)化好的3個多肽質(zhì)譜參數(shù)輸入SRM列表，初步建立SRM 方法，進(jìn)一步通過優(yōu)化流動相和洗脫程序來完善分析方法。與其他甲醇-水等流動相體系相比，選用乙腈-甲酸水體系時，各多肽離子對的響應(yīng)提高，且色譜峰形良好。通過優(yōu)化色譜洗脫條件，最終各分析物及內(nèi)標(biāo)的出峰時間為1.89～8.03 min，能夠?qū)崿F(xiàn)快速分離和分析（圖4）。

圖4 片仔癀3個特征肽及內(nèi)標(biāo)的提取離子流圖

2.3.2 方法學(xué)驗證 方法學(xué)驗證結(jié)果見表4。3 個特征肽LLOD 與LLOQ 分別為3.9、7.8 ng·mL–1，線性范圍為7.8～10 000.0 ng·mL–1，日內(nèi)精密度RSD≤13.45%，重復(fù)性RSD 8.46%～27.51%，穩(wěn)定性RSD≤35.41%，方法靈敏度高，線性關(guān)系、精密度與重復(fù)性良好，符合多肽的定量要求。

表4 片仔癀3個特征肽的RPLC-SRM定量方法學(xué)驗證結(jié)果

2.4 各批片仔癀定量結(jié)果

11 批片仔癀目標(biāo)多肽含量的測定見表5。結(jié)果顯示，3 個特征肽在11 批片仔癀樣品中均被檢出，ALSSALHER 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.06～0.44 μg·g–1，TLLEGEESR 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.08～0.26 μg·g–1，VAPLGEEFR 質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，為0.27～1.09 μg·g–1。除PTH9之外，3個特征肽在其余10批片仔癀中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為VAPLGEEFR>ALSSALHER>TLLEGEESR，不同批間均一性較好。

表5 RPLC-SRM定量分析11批片仔癀中目標(biāo)多肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 結(jié)論

本研究采用LC-MS 實現(xiàn)了片仔癀中蛋白的鑒定及特征肽的定量分析?；邙B槍法蛋白組學(xué)策略，采 用nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS，結(jié) 合UniProt 數(shù)據(jù)庫，共從片仔癀中鑒別了來源于200 個蛋白的343 個肽段，從中篩選3 個特征肽（ALSSALHER、TLLEGEESR、VAPLGEEFR）作為其質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行分析?；诓灰蕾囉趯φ掌返膐nline ER-MS 策略，獲得了3 個目標(biāo)多肽的定量離子對及OCE，其優(yōu)化結(jié)果顯著優(yōu)于Skyline軟件預(yù)測的質(zhì)譜參數(shù)，且與利用對照品手動優(yōu)化相比，節(jié)省了多肽對照品及分析時間。建立的RPLC-SRM 分析方法方法學(xué)驗證結(jié)果良好，11 批片仔癀中3 個特征肽的含量穩(wěn)定，各批間樣品均一性較好，其中多肽VAPLGEEFR 含量最高。本研究可為片仔癀的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升及含有動物藥藥味的中成藥質(zhì)量分析提供參考。