汪金葉，王升，張燕，張乃嘦，楊明，小杉実加，孫楷*，郭蘭萍*

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；

2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700；

3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 中藥材生物學(xué)與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；

4.德興市中醫(yī)研究院 試驗(yàn)培訓(xùn)基地，江西 德興 334220；

5.盛實(shí)百草藥業(yè)有限公司，天津 300301；

6.株式會(huì)社津村，日本 300-1192

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.（俗稱烏拉爾甘草）、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖[1]。其藥用歷史悠久，素有“十方九草，無草不成方”之稱[2-3]。甘草發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是黃酮類和三萜皂苷類化合物，其中甘草酸和甘草苷是評(píng)價(jià)甘草藥材質(zhì)量的主要指標(biāo)成分[4]。除了藥用，甘草還可用于干旱和半干旱地區(qū)退化生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)，在食品、日用化工及畜牧業(yè)等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用[5]。烏拉爾甘草是歷代甘草的主要藥材來源，其品質(zhì)和藥效更佳。巨大的市場(chǎng)需求使野生烏拉爾甘草遭到過度采挖，資源面臨枯竭，人工栽培甘草成為目前甘草藥材商品市場(chǎng)供應(yīng)的重要來源[6-8]。由于生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)期的不同，栽培與野生甘草藥材之間存在較大質(zhì)量差異，人工栽培甘草有效成分含量難以達(dá)標(biāo)，制約了甘草產(chǎn)業(yè)發(fā)展[9]。因此，加強(qiáng)烏拉爾甘草人工栽培技術(shù)研究，提高其藥材質(zhì)量，是解決甘草資源匱乏的根本途徑[10]。

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是廣泛存在于陸地生態(tài)系統(tǒng)土壤中的一類真菌，能侵染自然界中約90%維管植物的根系，與其建立互惠互利的菌根共生體[11]。AM真菌能通過該共生體系發(fā)揮諸多生理和生態(tài)功能，如促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)植物對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收與利用、提高宿主植物的抗逆性和抗病性、改善土壤成分和肥力等[12-13]。在干旱地區(qū)接種AM 真菌可以增強(qiáng)植物在水分缺乏、養(yǎng)分貧瘠環(huán)境下的生存競(jìng)爭(zhēng)能力[14]。AM真菌具有豐富的物種多樣性、功能多樣性和遺傳多樣性，近年來作為菌根生物肥料在農(nóng)業(yè)、園藝和生態(tài)修復(fù)等領(lǐng)域得到較為廣泛的應(yīng)用，其與藥用植物共生效應(yīng)的研究也受到越來越多的關(guān)注[15-16]。大量研究表明，AM 真菌在藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育、活性物質(zhì)生物合成和積累及脅迫抗性等方面均發(fā)揮著積極作用[17]；接種AM 真菌能顯著促進(jìn)甘草營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，以及干物質(zhì)與有效成分的積累[18-20]。AM 真菌與甘草共生效應(yīng)的深入研究對(duì)推進(jìn)甘草生態(tài)種植和提高栽培甘草藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。

現(xiàn)有研究多在室內(nèi)盆栽條件下開展，受限于實(shí)驗(yàn)室條件且栽培時(shí)間相對(duì)較短，尚未有大田條件下甘草長(zhǎng)期菌根化育苗的研究報(bào)道。AM 真菌效應(yīng)的發(fā)揮在田間可能受到AM 真菌種類、寄主、土壤環(huán)境與接種方法等諸多因素的影響，導(dǎo)致結(jié)果與室內(nèi)盆栽研究產(chǎn)生差異，因此有必要開展田間試驗(yàn)，為進(jìn)一步探索甘草菌根化育苗技術(shù)和甘草多菌種聯(lián)合接種育苗提供科學(xué)依據(jù)。本研究以烏拉爾甘草為研究對(duì)象，選取摩西斗管囊霉Funneliformis mosseae（Fm）與根內(nèi)根孢囊霉Rhiaophagus intraradices（Ri）為接種的AM 真菌菌種，設(shè)置獨(dú)立與雙重接種試驗(yàn)處理，在野外條件下進(jìn)行了為期2 年的田間試驗(yàn)，考察不同菌種與接種方式對(duì)甘草生長(zhǎng)指標(biāo)與甘草酸、甘草苷含量的影響，以期促進(jìn)甘草生產(chǎn)中AM真菌菌劑的合理利用。

1 材料

1.1 甘草種子及菌劑

甘草種子采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心郭蘭萍研究員鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的種子，種子千粒質(zhì)量為10～12 g，采用常規(guī)栽培管理。AM 真菌菌株摩西斗管囊霉Funneliformis mosseae與根內(nèi)根孢囊霉Rhiaophagus intraradices由長(zhǎng)江大學(xué)吳強(qiáng)盛教授提供，使用“浙鳳糯3 號(hào)”玉米（浙江大學(xué)作物科學(xué)研究所）與瑞文德白三葉草（北京市種子公司）混合擴(kuò)繁。

1.2 儀器

1260 型高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）；ME204 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；Pacific T-Ⅱ型超純水儀（美國Thermo 公司）；SB-800DTD 型超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試藥

對(duì)照品甘草苷（批號(hào)：111610-201908，純度：95.0%）、甘草酸銨（批號(hào)：110731-202021，純度：96.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；磷酸、無水乙醇（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技公司）；乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于內(nèi)蒙古赤峰市喀喇沁旗甘草培育基地（N41°55′，E118°41′）進(jìn)行。試驗(yàn)地土壤基本理化性質(zhì)見表1。設(shè)置單獨(dú)接種Ri、單獨(dú)接種Fm、復(fù)合接種Fm+Ri 和對(duì)照（CK），4 個(gè)菌劑接種試驗(yàn)處理組。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，采用田間小區(qū)試驗(yàn)，小區(qū)面積為4 m2，小區(qū)間設(shè)置隔離，播種密度為60 g/小區(qū)。AM 真菌在甘草播種時(shí)進(jìn)行接種，將菌劑等量加入每個(gè)播種穴內(nèi)，每克菌劑含孢子（50.0±9.7）個(gè)，每小區(qū)使用菌劑1 kg。雙重接種處理組中2 種菌劑等量混勻，所有接種處理組菌劑的總接種量保持一致。對(duì)照組加入等量經(jīng)高溫滅菌的菌劑。接種后3 個(gè)月采用醋酸墨水染色法[21]染色、網(wǎng)格交叉法[22]與計(jì)數(shù)方法[23]統(tǒng)計(jì)侵染率，F(xiàn)m 處理組的侵染率為（36.7±5.5）%、Ri 處理組的侵染率為（42.4±4.3）%、Fm+Ri 處理組的侵染率為（47.8±4.6）%，表明該方法能有效侵染菌根。

表1 甘草不同處理組土壤理化性質(zhì)

2.2 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

分別于播種后的第1 年9 月和第2 年9 月對(duì)甘草進(jìn)行取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取12 株，測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)株高、主根長(zhǎng)、根干質(zhì)量、莖干質(zhì)量與蘆頭直徑，取平均值。甘草株高、主根長(zhǎng)采用鋼卷尺測(cè)量，蘆頭直徑采用游標(biāo)卡尺測(cè)量，生物量采用天平稱量。

2.3 甘草酸和甘草苷含量測(cè)定

分別于播種后的第1 年9 月和第2 年9 月對(duì)甘草進(jìn)行取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取12 株，每4 株作為1 個(gè)混合樣，晾干，采用常溫、避光、防潮方式保存。樣品粉碎后過60 目篩，40 ℃烘烤48 h，按《中華人民共和國藥典》2020 年版（一部）甘草藥材【含量測(cè)定】項(xiàng)下方法[1]測(cè)定甘草酸和甘草苷含量。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入與整理，運(yùn)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果

3.1 不同接種處理對(duì)甘草生長(zhǎng)指標(biāo)和生物量的影響

接種AM 真菌后，不同處理組間甘草的生長(zhǎng)指標(biāo)表現(xiàn)出一定差異（圖1）。第1 年，復(fù)合接種處理對(duì)甘草的株高、主根長(zhǎng)、莖干質(zhì)量、根干質(zhì)量無顯著影響，單獨(dú)接種Ri 與單獨(dú)接種Fm 顯著降低了甘草的株高、莖干質(zhì)量與蘆頭直徑，所有接種處理均顯著降低了甘草的蘆頭直徑。第2 年，除單獨(dú)接種Ri 與單獨(dú)接種Fm 顯著降低了甘草的株高外，其他處理組間株高、主根長(zhǎng)、莖干質(zhì)量、根干質(zhì)量與蘆頭直徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同AM真菌獨(dú)立與雙重接種對(duì)甘草生長(zhǎng)的影響（,n=4）

各生長(zhǎng)指標(biāo)在不同處理組內(nèi)的增長(zhǎng)動(dòng)態(tài)與規(guī)律存在差異。第2年，3個(gè)接種處理組甘草的主根長(zhǎng)與根干質(zhì)量與第1年相比均有顯著增長(zhǎng)，而CK 增長(zhǎng)不顯著。單獨(dú)接種的2 個(gè)處理組甘草的蘆頭直徑與第1 年相比均有顯著增長(zhǎng)，復(fù)合接種組與CK 相比增長(zhǎng)不顯著。與CK 相比，各處理組的株高、莖干質(zhì)量均有顯著增長(zhǎng)。

3.2 不同接種處理對(duì)甘草酸和甘草苷積累的影響

不同處理組間甘草酸與甘草苷含量有較大差異（圖2）。在接種的第1年，接種處理未顯著改變甘草的甘草苷含量；接種的第2 年，復(fù)合接種處理組甘草的甘草苷含量顯著高于CK，其次為單獨(dú)接種Fm處理，而單獨(dú)接種Ri 甘草的甘草苷含量與CK 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在接種的第1 年，所有接種處理組的甘草酸含量與CK 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；接種的第2年，復(fù)合接種與單獨(dú)接種Fm處理組甘草的甘草酸含量顯著高于CK，而單獨(dú)接種Ri 處理組甘草苷含量顯著低于CK。在不同處理組內(nèi)，甘草酸與甘草苷的積累動(dòng)態(tài)存在差異。3 個(gè)接種處理組甘草酸與甘草苷含量較第1 年均有顯著增加，對(duì)照組甘草酸含量增加顯著，而甘草苷含量無顯著增加。

圖2 不同AM真菌獨(dú)立與雙重接種對(duì)甘草酸及甘草苷積累的影響（,n=4）

3.3 不同接種處理對(duì)甘草酸與甘草苷積累相關(guān)度的影響

與CK 相比，單獨(dú)接種Fm 處理組、單獨(dú)接種Ri處理組及復(fù)合接種處理組中2 年間甘草酸與甘草苷含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖3），表明接種AM 真菌處理后，甘草酸與甘草苷積累保持了穩(wěn)定的成比例線性增長(zhǎng)關(guān)系。在不同接種處理下，甘草酸與甘草苷線性關(guān)系的斜率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖3 不同AM真菌獨(dú)立與雙重接種處理下甘草酸及甘草苷的線性分析

3.4 不同接種處理對(duì)甘草苷含量與甘草酸含量比值（苷酸比）的影響

不同處理組的苷酸比相比CK均有顯著提高，且增長(zhǎng)程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖4）。其中，單獨(dú)接種Ri處理組對(duì)甘草的苷酸比提升最為明顯，其次為復(fù)合接種處理組，再次為單獨(dú)接種Fm處理組。

圖4 不同AM真菌獨(dú)立與雙重接種對(duì)苷酸比的影響（,n=4）

4 討論

本研究結(jié)果表明，在大田條件下復(fù)合接種Fm與Ri 可以顯著提升烏拉爾甘草中甘草酸與甘草苷的含量，有助于甘草品質(zhì)的提升。Amanifer 等[24]發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室條件下單獨(dú)接種Fm能促進(jìn)光果甘草植株的生長(zhǎng)并增加甘草酸的含量；Xie等[25]的室內(nèi)研究試驗(yàn)表明，單獨(dú)接種Ri 可以促進(jìn)甘草生長(zhǎng)和增加甘草酸和甘草苷的積累；Liu 等[26]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)m 與地表球囊霉混合接種可以促進(jìn)甘草生長(zhǎng)和甘草酸積累，但兩者并非協(xié)同作用；王振楠等[27]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)m 與Ri混合接種對(duì)促進(jìn)紅花生長(zhǎng)和產(chǎn)量增加效果最好；Zubek等[28]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)m 與異型根孢囊霉Rhizophagus irregularis混合接種可增加三色堇中黃酮類化合物含量；還有研究表明，F(xiàn)m 與Ri 在提高酚類物質(zhì)含量上具有協(xié)同效應(yīng)[29]。然而，此前尚未有研究對(duì)甘草雙重接種Fm與Ri 的效果進(jìn)行探究，甘草接種AM 真菌后在田間的長(zhǎng)期真實(shí)效果也尚未見報(bào)道。本研究證實(shí)了大田條件下，F(xiàn)m 與Ri 雙重接種對(duì)甘草酸和甘草苷的積累有協(xié)同促進(jìn)作用。

本研究中2種AM真菌雙重接種的協(xié)同增效可能與不同菌種間的功能互補(bǔ)有關(guān)。前人研究表明，AM真菌的不同分類群具有功能互補(bǔ)性，在混合接種時(shí)產(chǎn)生協(xié)同作用[30]。Koide 等[31]提出，根部AM 真菌菌種間存在磷吸收的功能互補(bǔ)；Jansa 等[32]發(fā)現(xiàn)，接種根內(nèi)球囊霉和近明球囊霉Claroideoglomus claroideum對(duì)韭蔥磷吸收促進(jìn)作用優(yōu)于單接種，認(rèn)為AM 真菌之間的協(xié)同作用可能是基于真菌對(duì)磷吸收的差異；李響[33]研究表明，盆栽條件下Fm與Ri混合接種相比單獨(dú)接種能更好地促進(jìn)毛紅椿幼苗生長(zhǎng)和提高氮、磷、鉀吸收量；Crossay 等[34]發(fā)現(xiàn)，來自不同類群的AM 真菌混合接種比單一接種能更有效地提高植物生物量、礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、鈣鎂比和對(duì)重金屬的耐受性。另外，具有協(xié)同作用的AM 真菌群落還可更好地促進(jìn)土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性，繼而可改善土壤營(yíng)養(yǎng)狀況[35]。相較單菌種接種，具有協(xié)同互補(bǔ)作用的2種AM真菌菌劑聯(lián)用在生產(chǎn)中可能更具備優(yōu)勢(shì)。

本研究進(jìn)行了大田條件下甘草2種AM真菌的雙重接種，但大田試驗(yàn)存在多種不可控因素對(duì)宿主植物產(chǎn)生不確定影響，引入更多種AM 真菌混合接種或AM 真菌與根瘤菌（rhizobium）聯(lián)用是否對(duì)大田條件下產(chǎn)量品質(zhì)的穩(wěn)定提高有更佳的作用尚待探索。大田中復(fù)雜的土壤理化性質(zhì)、微生物環(huán)境及氣象因素等都可能導(dǎo)致大田試驗(yàn)結(jié)果異于室內(nèi)盆栽試驗(yàn)。首先，大田中植物可利用土壤資源相對(duì)較大，有利于植物的營(yíng)養(yǎng)獲取，不利于AM 真菌改善營(yíng)養(yǎng)作用的體現(xiàn)[36]；其次，試驗(yàn)期內(nèi)較多的降水可導(dǎo)致AM真菌緩解干旱脅迫的作用無法充分展現(xiàn)[37]；此外，Verbruggen 等[38]認(rèn)為，物種兼容性、田間承載能力和優(yōu)先效應(yīng)是影響AM真菌對(duì)植物作用的3個(gè)決定性因素。復(fù)雜菌劑可能更有利于在大田條件下形成優(yōu)勢(shì)，如有研究表明接種4 種或6 種AM 真菌的混合菌劑后，滇重樓和木香的生長(zhǎng)發(fā)育與有效成分含量均得到顯著提升[39-40]；Liu等[41]發(fā)現(xiàn)，含有6種球囊霉混合菌劑聯(lián)合作用可以增加甘草地上部和根部干質(zhì)量；干旱脅迫下，AM 真菌和根瘤菌共同接種可以更有效地促進(jìn)甘草生長(zhǎng)和提高抗旱能力[42]。未來，研制低價(jià)高效、性效穩(wěn)定的甘草專用多菌聯(lián)用菌劑是一個(gè)重要方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，接種AM 真菌后，烏拉爾甘草中甘草酸與甘草苷的比例發(fā)生了顯著變化，具體表現(xiàn)為甘草苷相對(duì)比例的顯著增加。同時(shí)，在2 年的栽培中，所有接種組甘草苷與甘草酸的積累速率均維持較為穩(wěn)定的增長(zhǎng)，并與CK 形成明顯差異。前人研究發(fā)現(xiàn)，栽培甘草中甘草酸與甘草苷呈正相關(guān)，但隨著生長(zhǎng)年限增加，甘草苷與甘草酸的比例呈逐年下降趨勢(shì)，表明甘草苷較甘草酸更難積累[43]。Xie等[25]的研究也表明，接種Ri 可提高甘草苷與甘草酸的比值。此外有研究發(fā)現(xiàn)，接種AM 真菌可改變茅蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)醇、β-桉葉油醇及蒼術(shù)素和廣藿香揮發(fā)油中廣藿香醇及δ-愈創(chuàng)木烯的相對(duì)百分含量，促進(jìn)主要有效成分的積累，從而提高品質(zhì)和產(chǎn)量[44-45]。接種AM 真菌對(duì)甘草中苷酸比有提升作用，有助于提高甘草的質(zhì)量。目前對(duì)于AM 真菌如何改變苷酸比的機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

本研究探索了Fm 與Ri 2 種AM 真菌對(duì)于甘草種苗生長(zhǎng)與有效成分積累的影響，發(fā)現(xiàn)大田條件下復(fù)合接種對(duì)甘草酸和甘草苷的積累有協(xié)同促進(jìn)作用。目前，僅觀察到AM 真菌復(fù)合接種的效果，其協(xié)同增效的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究成果為甘草生產(chǎn)中AM真菌菌劑的合理利用提供了參考。