陳麗華，楊秀偉*，白雪媛，趙大慶

1.北京大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物學(xué)系/天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；

2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130000

人參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖[1]，具有大補(bǔ)元?dú)?、生津養(yǎng)血、補(bǔ)脾益肺、安神益智等功效[2-3]，被譽(yù)為“百草之王”。林下山參也稱籽海、籽貨、育山參等，是通過(guò)人工方式將人參種子播種在深山密林中，在野生環(huán)境下自然生長(zhǎng)且10 多年后采收的半野生山參[4-5]。鮮人參晶是一種口服人參凍干品，以鮮人參為原料，采用現(xiàn)代工藝（特殊的高壓、研磨技術(shù)及先進(jìn)的凍干技術(shù)）加工制成，能溶出全部活性成分并充分發(fā)揮其作用，具有活性高、吸收好、起效快、服用方便等特點(diǎn)。

人參皂苷是人參的主要活性成分，也是評(píng)價(jià)人參的主要指標(biāo)，現(xiàn)代藥理學(xué)和生物活性研究表明人參皂苷具有廣泛的藥理、藥效作用[3,6-7]。根據(jù)苷元的不同，人參皂苷可分為原人參二醇型（PPD）、原人參三醇型（PPT）及齊墩果酸型（OA）[8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，林下山參中的人參皂苷與栽培人參相比雖然種類沒(méi)有變化，但單體人參皂苷的含量卻有顯著差異，且前者的總?cè)藚⒃碥蘸恳策h(yuǎn)高于后者[9-11]。鑒于此，本研究選擇林下山參與鮮人參晶進(jìn)行比較，探究?jī)烧叩娜藚⒃碥蘸坎町悺?/p>

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，超快速液相色譜-質(zhì)譜法（UFLC-MS/MS）在醫(yī)藥、食品、化工等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[12-13]。與傳統(tǒng)的高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法（HPLC-UV）和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）相比，UFLC-MS/MS 顯示出高效快速的分離能力和超高的靈敏度，可以克服人參皂苷在分析時(shí)需衍生化及由于分子離子豐度低難檢測(cè)等問(wèn)題[14]。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式則通過(guò)去除不符合規(guī)則的信號(hào)干擾，從而達(dá)到高靈敏度、高準(zhǔn)確性和特異性的靶向定量檢測(cè)效果[15]。因此，本研究采用UFLC-MS/MS 測(cè)定林下山參及鮮人參晶中人參皂苷的含量，為鮮人參晶和林下山參的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及營(yíng)養(yǎng)保健作用研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

島津LCMS-8050 型超高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，其中Nexera X2 型超高效液相系統(tǒng)（配置LC-30AD型二元泵、SIL-30AC 型自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M30A 型檢測(cè)器和CTO-20AC 型柱溫箱）與三重四極桿質(zhì)譜儀串聯(lián)，配有電噴霧離子源（ESI）及LabSolution LCMS V 5.65 工作站軟件；XS105DU 型十萬(wàn)分之一電子天平、ME204T/02 型萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ5200型超聲波系統(tǒng)（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超純水機(jī)（Merck Millipore公司）。

1.2 試藥

20年生林下山參（批號(hào)：LXS-201308，編號(hào)：1）于2013 年8 月采自吉林省撫松縣東崗鎮(zhèn)；20 年生林下山參（批號(hào)分別為L(zhǎng)XS-202001、LXS-202002、LXS-202003，編號(hào)為2～4）于2020 年采于吉林省白山市撫松縣露水河鎮(zhèn)，所有樣品均經(jīng)吉林省人參科學(xué)研究院趙大慶教授鑒定為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖；鮮人參晶（批號(hào)：XRSJ-202112，編號(hào)：5）由北京同仁堂健康藥業(yè)（遼寧）有限公司提供，原料林下山參經(jīng)遼寧省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院董英杰教授鑒定為15 年生以上人參P.ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，產(chǎn)地為遼寧省寬甸縣；所有憑證標(biāo)本存放在北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

對(duì)照品人參皂苷Ra1（G-Ra1，1）、G-Ra2（2）、G-Ra3（3）、G-Rb1（4）、G-Rb2（5）、G-Rb3（6）、G-Rc（7）、G-Rd（8）、G-Re（9）、G-Rs1（10）、20(S)-G-Rs3（S-Rs3，11）、20(R)-G-Rs3（R-Rs3，12）、G-Rs4（13）、G-Rg6（14）、G-F4（15）、G-Rg1（16）、20(S)-G-Rf（S-Rf，17）、20(R)-G-Rf（R-Rf，18）、20(S)-G-Rg2（S-Rg2，19）、20(R)-G-Rg2（R-Rg2，20）、20(S)-G-Rg3（S-Rg3，21）、20(R)-G-Rg3（R-Rg3，22）、G-F2（23）、20(S)-三七皂苷（NG）R2（24）、20(R)-NG-R2（25）、G-Rk1（26）、G-Rg5（27）、G-Rh4（28）、G-Rk3（29）、20(S)-G-Rh1（S-Rh1，30）、20(R)-G-Rh1（R-Rh1，31）、G-Rh2（32）、20(S)-PPT（S-PPT，33）、西洋參皂苷R1（Q-R1，34）、G-Ro（35）、NG-R1（36）、G-Rg9（38）及20-glu-G-Rf（20-glu-Rf，39）為本課題組從生曬參[16-17]、紅參[18-20]及人參莖葉[21-22]中分離得到；竹節(jié)參皂苷Ⅳa（CS-Ⅳa，37）購(gòu)自成都普思生物科技有限公司；各對(duì)照品純度均大于98%。

質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈、甲酸銨均購(gòu)自Fisher 公司；色譜純甲醇購(gòu)于天津西華特種試劑廠；超純水（18 MΩ·cm–1）為本實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC? BEH Shield RP C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），配備Waters ACQUITY UPLC? BEH Shield RP C18VanGuard?預(yù)柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.5 mmol·L–1甲酸銨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，22%B；3～5 min，22%～30%B；5～9 min，30%～35%B；9～11 min，35%～36%B；11～14 min，36%～48%B；14～20 min，48%～51%B；20～22 min，51%～75%B；22～25 min，75%～80%B；25～27 min，80%～90%B；27～30 min，90%B）；柱溫為40 ℃；流速為0.35 mL·min–1；進(jìn)樣量為2 μL。

優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)：接口加熱器溫度為300 ℃；脫溶劑管溫度為250 ℃；接口電壓為3 kV；檢測(cè)器電壓為1.7 kV；霧化氣流速為3 L·min–1；干燥氣和加熱氣流速均為10 L·min–1；負(fù)離子模式，電噴霧離子源（ESI），掃描方式為MRM。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取39 個(gè)人參皂苷對(duì)照品適量，用質(zhì)譜級(jí)甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL–1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，于–20 ℃密封保存。分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用質(zhì)譜級(jí)甲醇稀釋并制成質(zhì)量濃度為1.0～10.0 μg·mL–1的混合對(duì)照品母液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.3 供試品溶液的配制

參照本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)的處理方法[18]，精密稱取過(guò)40 目篩的樣品粉末0.500 00 g（±0.000 1 g）于50 mL離心管中，精密加入70%甲醇水溶液40 mL，常溫超聲提取60 min。5000 r·min–1（離心半徑為10 cm）離心10 min，取上清液適量，用70%甲醇水10倍稀釋，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，作為供試品溶液。每批樣品分別平行制備3份。

2.4 方法學(xué)考察

取適量混合對(duì)照品母液，用甲醇逐級(jí)倍比稀釋，得到系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品線性工作液。以信噪比（S/N）=3 為檢測(cè)下限（LLOD），S/N=10 為定量下限（LLOQ）。通過(guò)對(duì)同一對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為125 ng·mL–1）進(jìn)行如下操作：同日內(nèi)重復(fù)6 次或連續(xù)進(jìn)樣3 d（每天進(jìn)樣3 次），測(cè)定各分析物的峰面積，分別計(jì)算日內(nèi)和日間精密度的RSD。

按2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定各分析物的含量，計(jì)算RSD，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。取同一供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24、48 h，按照2.1 項(xiàng)下條件測(cè)定各分析物的峰面積，計(jì)算RSD，評(píng)估所有分析物的穩(wěn)定性。精密稱取同一批鮮人參晶樣品9 份，分別加入不同質(zhì)量濃度（低、中、高）的混合對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度按2.3 項(xiàng)下方法平行制備3 份，按2.1 項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

3 結(jié)果

3.1 UFLC-MS/MS條件的優(yōu)化

基于本課題組前期對(duì)人參皂苷UFLC-MS/MS 條件的研究[18,23]，將流動(dòng)相確定為乙腈和0.5 mmol·L–1甲酸銨水溶液，在保留時(shí)間（tR）30 min內(nèi)，所有分析物（包括11 對(duì)同分異構(gòu)體）于負(fù)離子模式下得到完全分離，39 個(gè)人參皂苷混合對(duì)照品及樣品的MRM 疊加色譜圖見(jiàn)圖1。其中，[M+HCOO]–作為G-Rg6、G-F4、G-Rk3和G-Rh4的母離子，因?yàn)槠潇`敏度和離子強(qiáng)度均高于相應(yīng)的去質(zhì)子化離子[M–H]–，而其他分析物則選擇加合離子[M–H]–更合適。各人參皂苷分析物的tR、母離子、離子對(duì)信息、1 極預(yù)偏置電壓（Q1）、3 極預(yù)偏置電壓（Q3）、碰撞能量（CE）及滯留時(shí)間（DT）的優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 39個(gè)人參皂苷分析物的tR及MRM優(yōu)化參數(shù)

圖1 人參皂苷混合對(duì)照品和樣品的MRM疊加色譜圖

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

在各自線性質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，39 個(gè)人參皂苷以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），r為0.999 0～0.999 9，LLOD 為0.10～2.58 μg·L–1，LLOQ為0.33～7.87 μg·L–1（表2）；日內(nèi)和日間精密度RSD 分別為0.69%～4.40%和0.74%～3.85%，表明儀器精密度良好；各分析物的重復(fù)性試驗(yàn)含量的RSD 為1.15%～3.83%，穩(wěn)定性試驗(yàn)峰面積RSD 為1.03%～4.29%，表明方法重復(fù)性及所有分析物的穩(wěn)定性良好；39 個(gè)分析物的平均回收率為92.38%～103.73%，RSD 為0.41%～4.74%，具體結(jié)果見(jiàn)表3。分析方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證符合分析物的定量分析要求。

表2 人參中39個(gè)人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、LLOD和LLOQ

表3 39個(gè)人參皂苷含量測(cè)定的日內(nèi)及日間精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率

3.3 樣品中人參皂苷的含量測(cè)定

按2.3項(xiàng)下方法制備5批樣品的供試品溶液，每批重復(fù)3次，按2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄各分析物峰面積，以外標(biāo)對(duì)照品法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 鮮人參晶和林下山參樣品中人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=5）

表4 鮮人參晶和林下山參樣品中人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=5）

注：ND.未檢出；*表示稀有人參皂苷或苷元。

林下山參和鮮人參晶中的總?cè)藚⒃碥召|(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為27.59～52.63、52.26 mg·g–1（表4）。本課題組前期研究顯示，栽培人參根和根莖中總?cè)藚⒃碥召|(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.37～35.44 mg·g–1[23-24]，15～30 年林下山參總?cè)藚⒃碥召|(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.50～38.55 mg·g–1[17]，紅參與白參中總?cè)藚⒃碥召|(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24.14～35.33、17.54～26.76 mg·g–1[18]。結(jié)果顯示，所測(cè)的鮮人參晶中總?cè)藚⒃碥蘸窟h(yuǎn)高于栽培人參，甚至高于紅參，一定程度上說(shuō)明經(jīng)過(guò)特殊的高壓、研磨技術(shù)及先進(jìn)的凍干技術(shù)，促使鮮人參晶中溶出大量的人參皂苷活性成分；林下山參中的總?cè)藚⒃碥談t因采集時(shí)間、地點(diǎn)等原因呈現(xiàn)不同的含量差異。因此，種植環(huán)境、采集、保存時(shí)間和加工可能是影響人參皂苷含量的重要因素。

4 討論

G-Rb1、G-Re 和G-Rg1是人參藥材中的代表性指標(biāo)成分，用于評(píng)價(jià)人參是否合格?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版中規(guī)定：本品按干燥品計(jì)算，含G-Rg1（C42H72O14）和G-Re（C48H82O18）的總量不得少于0.30%，G-Rb1（C54H92O23）不得少于0.20%[1]。據(jù)表4計(jì)算可得，林下山參中GRb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.24%～0.53%，G-Rg1和G-Re 的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.72%～0.94%；鮮人參晶中G-Rb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.43%，G-Rg1和G-Re 的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.21%。上述結(jié)果表明，林下山參與鮮人參晶均符合《中國(guó)藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)中的含量規(guī)定，且鮮人參晶G-Rg1和G-Re 的總含量遠(yuǎn)高于《中國(guó)藥典》2020 年版的含量要求，因此，其內(nèi)在質(zhì)量具有較好的保證。

隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展和對(duì)人參深入系統(tǒng)的研究，研究者發(fā)現(xiàn)人參皂苷是人參發(fā)揮藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，已有大量研究報(bào)道了人參皂苷具有抗腫瘤、抗衰老、降血糖、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)及調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)的作用[25-27]，尤其是稀有人參皂苷，如G-Rg5、GRg3、G-Rk1、G-Rh1、G-Rh2及G-Rh4等[28-30]。由于野生人參瀕臨滅絕，目前長(zhǎng)白山區(qū)系大力發(fā)展在天然林原始生境中直播人參的方式（原生態(tài)模式）生產(chǎn)的野山參（林下山參，暫定名為Panax ginsengC.A.Mey.cv.‘Silvaticus’）其“五形六體”與野生人參相當(dāng)或一致[31]。表4結(jié)果顯示，林下山參和鮮人參晶中稀有人參皂苷（G-Rg6、G-F4、S-Rg3、R-Rg3、G-Rg5、G-Rk1、G-Rh4、G-Rk3、S-Rh1、R-Rh1、GRh2、S-PPT）總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為208.55～429.19、334.95 μg·g–1，提示鮮人參晶可能具有較高的生物活性，有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。

除稀有人參皂苷以外，人參中含有豐富的常見(jiàn)人參皂苷，如G-Ra3、G-Rb2、G-Rc、G-Rd 和G-Ro等，含量之和約占總?cè)藚⒃碥盏?0%以上[8]，本研究從5 批樣品中檢測(cè)到的常見(jiàn)人參皂苷總含量占比均高達(dá)95%以上。另外，單個(gè)人參皂苷在不同批次中各有差異，其中鮮人參晶中含量最高的人參皂苷個(gè)數(shù)為11 個(gè)，分別是G-Re、R-Rs3、G-Rg6、G-Rg1、S/R-Rf、S/R-Rg2、R-Rg3、R-Rh1及G-Ro，其余則分布在林下山參的不同批次中，其中LXS-202003樣品中分布的個(gè)數(shù)高達(dá)12 個(gè)，LXS-201308、LXS-202001、LXS-202002 樣品中含量最高的化合物分別為7、6、1 個(gè)。值得注意的是，批次為L(zhǎng)XS-201308的樣品中不含S/R-Rs3和G-Rs4，且G-Rh2只存在于該批樣品中，有可能受采集時(shí)間和地點(diǎn)的影響。

本研究建立了同時(shí)測(cè)定39 個(gè)人參皂苷的UFLCMS/MS 分析方法，含量檢測(cè)結(jié)果在一定程度上說(shuō)明，采用現(xiàn)代工藝技術(shù)開(kāi)發(fā)的鮮人參晶，確實(shí)能溶出并較好地保存人參皂苷活性成分，充分保留了人參精華成分，從而發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能。其與林下山參比較，盡管人參皂苷含量有一定差異，但種類幾乎無(wú)變化。為進(jìn)一步評(píng)估并確保鮮人參晶的質(zhì)量與功效，有必要對(duì)更多批次的鮮人參晶樣品進(jìn)行含量測(cè)定及分析研究。