孫永新，韋 笑，曹 維

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 226001）

胃癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在癌癥相關(guān)死亡中位居第四[1]。2016 年我國(guó)新診斷癌癥4 064 000例,其中胃癌396 500 例,占9.8%,位居第三[2]。由于胃癌早期缺乏典型臨床表現(xiàn),多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期,預(yù)后較差。因此,發(fā)現(xiàn)有效的生物學(xué)標(biāo)記對(duì)胃癌的早期診斷和治療具有重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是指長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)堿基對(duì)而無(wú)蛋白編碼功能的RNA,在人類(lèi)細(xì)胞中廣泛表達(dá),在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（LUCAT1）作為一種LncRNA,在多種腫瘤組織中異常表達(dá),且與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲關(guān)系密切。本研究選取我院2015—2020 年手術(shù)切除的胃癌組織及配對(duì)癌旁正常組織18 例以及人胃癌細(xì)胞株,檢測(cè)LUCAT1 的表達(dá),探討LUCAT1 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響,旨在進(jìn)一步揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為尋找胃癌治療靶點(diǎn)提供線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)的胃癌患者18例,其中男性10 例,女性8 例,年齡38～85 歲,平均56±5 歲。手術(shù)切取的胃癌組織及其配對(duì)癌旁正常組織標(biāo)本置于液氮中保存待檢。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及腫瘤輔助治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR 檢測(cè)胃癌及癌旁組織中LUCAT1表達(dá):TRIzol 法提取組織樣本總RNA,采用Thermo Fisher 公司SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System 合成cDNA 第一鏈。使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)PCR 引物,由上海Invitrogen 公司合成。引物序列:LUCAT1 F:5’-GTGTCAAGCTCGGATTGCCT-3’,R:5’-GAGCCCACACACTCAGGTTC-3’;GAPDH F:5’-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3’;R:5’-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3’。以GAPDH 為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計(jì)算LUCAT1 相對(duì)表達(dá)水平。采用Power SYBRTMGreen PCR Master Mix 試劑盒,Light Cycler 96 PCR 儀檢測(cè)LUCAT1 表達(dá)。PCR 擴(kuò)增體系:SYBR Premix12.5 μL,Prime F 和R（10 μmol/L）各1 μL,cDNA 2 份,每份2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃30 s,PCR 反應(yīng)95 ℃5 s,60 ℃30 s,共40 個(gè)循環(huán)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):將4 種人胃癌細(xì)胞株（BGC-823,AGS,SGC7901,MKN45）培養(yǎng)于含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液中,置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA,參照1.2.1 中RT-qPCR實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)不同胃癌細(xì)胞株中LUCAT1 的表達(dá),選擇LUCAT1 高表達(dá)的SGC7901 細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-qPCR 法檢測(cè)各組SGC7901 細(xì)胞LUCAT1表達(dá):將SGC7901 細(xì)胞分為si-NC 組、si-LUCAT1組、pLV-NC 和pLV-LUCAT1 組,根據(jù)LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū),分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA、LUCAT1、siRNA 空載體質(zhì)粒及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pLV-LUCAT1,轉(zhuǎn)染后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。利用RT-qPCR 檢測(cè)各組細(xì)胞LUCAT1的表達(dá)水平以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。LUCAT1 引物序列:上游:5’-CUCAGUGUCACACAUUUCATT-3’,下游:5’-UGAAAUGUGUGACACUGAGTT-3’。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖:吸取各組SGC7901 細(xì)胞懸液100 μL（含2 000 個(gè)細(xì)胞）,置于96 孔板中培養(yǎng)72 h,每孔加入100 μL MTT 溶液（5 mg/mL）,在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan 溶解液,繼續(xù)孵育直至顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Formazan 全部溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,選擇570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度,繪制細(xì)胞活性曲線,實(shí)驗(yàn)設(shè)3復(fù)孔。

1.2.5 Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):采用無(wú)血清RPMI-1640 培養(yǎng)基按1:8 比例稀釋基質(zhì)膠,包被在Transwell 小室底部膜的上室面,37 ℃放置2 h 使基質(zhì)膠充分包被。取各組SGC7901 細(xì)胞懸液撤血清饑餓12～24 h,以進(jìn)一步去除血清影響。消化后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。用溫暖的無(wú)血清培養(yǎng)基輕洗形成膠狀的基質(zhì)膠,取100 μL細(xì)胞懸液加入上室,600 μL 含20%FBS 培養(yǎng)基加入下室,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用無(wú)鈣PBS洗2 遍,甲醇固定30 min,將小室適當(dāng)風(fēng)干。室溫下Gimusa 染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未侵襲細(xì)胞,用PBS 洗3 遍。200 倍顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察細(xì)胞,記數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,GraphPad 8.0 軟件繪圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s 表示,兩組間比較采用t 檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中LUCAT1 表達(dá) RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,胃癌組織中LUCAT1 表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 胃癌組織和癌旁正常組織中LUCAT1 表達(dá)

2.2 胃癌細(xì)胞中LUCAT1 表達(dá) LUCAT1 在BGC-823、AGS、SGC7901 及MKN45 胃癌細(xì)胞株中均有表達(dá),SGC7901 細(xì)胞LUCAT1 表達(dá)量顯著高于其他細(xì)胞株,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,選擇SGC7901 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖2。

圖2 胃癌細(xì)胞中LUCAT1 表達(dá)

2.3 各組SGC7901 細(xì)胞LUCAT1 表達(dá)比較 RTqPCR 結(jié)果顯示,si-LUCAT1 組中LUCAT1 表達(dá)較si-NC 組降低,而pLV-LUCAT1 組中LUCAT1 表達(dá)較pLV-NC 組增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。見(jiàn)圖3。

圖3 各組SGC7901 細(xì)胞中LUCAT1 表達(dá)

2.4 各組SGC7901 細(xì)胞增殖水平比較 MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示,si-LUCAT1 組細(xì)胞增殖水平顯著低于si-NC 組,pLV-LUCAT1 組細(xì)胞增殖水平顯著高于pLV-NC 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組SGC7901 細(xì)胞增殖曲線

2.5 各組SGC7901 細(xì)胞侵襲能力比較 Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,si-LUCAT1 組細(xì)胞的侵襲能力顯著低于si-NC 組（P＜0.05）,pLV-LUCAT1 組細(xì)胞的侵襲能力顯著高于pLV-NC 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

圖5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

3 討論

LncRNA 與DNA、RNA 和轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控DNA 甲基化、組蛋白修飾及染色質(zhì)重塑等多種生物學(xué)過(guò)程,在表觀遺傳、細(xì)胞周期和細(xì)胞分化調(diào)控等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前在多種人類(lèi)腫瘤中發(fā)現(xiàn)lncRNA 表達(dá)量的改變,如在腎癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR 主要通過(guò)影響特定基因位點(diǎn)H3K27 甲基化而調(diào)控基因表達(dá),最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡[3];在非小細(xì)胞肺癌中l(wèi)ncRNA LUCAT1 通過(guò)海綿化miR-493-5p 來(lái)調(diào)節(jié)RAC1 的表達(dá),從而影響非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)、遷移、侵襲和預(yù)后[4]。有研究證實(shí),LncRNA AK023391 可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)胃癌的發(fā)生和侵襲[5]。

肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本LUCAT1 位于5 號(hào)染色體14.3區(qū),因其通過(guò)表觀遺傳抑制P21 和P57 表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖而得名[6]。據(jù)報(bào)道,LUCAT1 通過(guò)調(diào)節(jié)miR-199a-5p 表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖[7]。近年來(lái),有文獻(xiàn)表明LUCAT1 在胃癌中表現(xiàn)惡性生物學(xué)行為,LUCAT1 表達(dá)水平與胃癌患者的分期和預(yù)后相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示,胃癌組織中LUCAT1表達(dá)顯著高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;LUCAT1 過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng),抑制LUCAT1 表達(dá)后胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力下降,提示LUCAT1 促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,有望成為胃癌診斷和治療的生物學(xué)指標(biāo)。