李夢(mèng)醒，劉 濤，王曉偉，金 海

（中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，上海 200433）

急性肺損傷（acute lung injury,ALI）是由多種直接或間接因素引起的一系列肺部改變和嚴(yán)重低氧血癥,死亡率和致殘率很高[1-3],是重癥監(jiān)護(hù)室的常見(jiàn)疾病。引起ALI 的病因及高危因素很多,其中肺部感染是主要原因[4-5],不同因素所致的ALI 病程及預(yù)后不同。ALI 病理生理機(jī)制包括炎癥反應(yīng)失調(diào)以及肺泡-毛細(xì)血管屏障破壞,在組織學(xué)上表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞型肺泡炎、肺泡內(nèi)透明膜沉積、微血管血栓形成等[6-7],ALI 發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,選擇合適的動(dòng)物模型對(duì)研究ALI 早期發(fā)病機(jī)制及治療方案至關(guān)重要。

動(dòng)物模型種類(lèi)繁多,嚙齒類(lèi)動(dòng)物體型小、成本低、遺傳背景單一,操作方便[8-9],常用來(lái)研究ALI。通常采用氣管、腹腔、尾靜脈注入具有導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）潛能的化學(xué)物質(zhì)如脂多糖、油酸、海水等建立ALI 動(dòng)物模型,此外還有創(chuàng)傷性和吸入性動(dòng)物模型[10-13]。由于小鼠模型誘導(dǎo)機(jī)械通氣和采集血液樣本較困難,不適合長(zhǎng)期研究[11],因此本次實(shí)驗(yàn)選擇大鼠氣管內(nèi)注入脂多糖和海水制備兩種ALI 模型,選擇這兩種模型是因?yàn)樗鼈兙哂懈叨鹊目芍貜?fù)性,可以誘發(fā)強(qiáng)中性肺泡炎和肺泡毛細(xì)血管膜破壞,易于滴定肺部炎癥程度,并可以評(píng)估ALI 的早期和轉(zhuǎn)歸階段,有助于我們對(duì)ALI 病理生理機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠28 只,體重200～300 g,購(gòu)于上海市生命計(jì)劃科學(xué)研究所[SPF 級(jí),合格證編號(hào):20180006036523,許可證號(hào):SCXK（滬）2018-0006]。飼養(yǎng)于長(zhǎng)海醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[使用許可證:SYXK（滬）2020-0030],常規(guī)喂養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 脂多糖（LPS）（Sigma 公司）:溶于無(wú)菌生理鹽水,配制成5 mg/mL 溶液;海水:按照我國(guó)東南沿海海水主要成分配制,NaCl 26.52 g/L,MgCl22.45 g/L,MgSO43.31 g/L,CaCl21.14 g/L,KCl 0.73 g/L,NaHCO30.202 g/L,NaBr 0.083 g/L,滲透壓濃度1 250～1 350 mmol/L,pH 8.2,比重1.05～1.06。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠ALI 模型建立:將28 只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（Control 組）4 只、脂多糖組（LPS 組）及海水淹溺組（SW 組）各12 只。實(shí)驗(yàn)前禁食8 h,自由飲水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg,待肢體疼痛反射消失后,仰臥在手術(shù)臺(tái)上并固定頭與四肢。頸部脫毛暴露皮膚,75%酒精消毒,正中切口1 cm 暴露氣管。以1 mL 注射器穿刺氣管,Control 組不予處理,LPS 組和SW 組按2 mL/kg 劑量于氣管內(nèi)分別勻速緩慢注入LPS 溶液和海水,3 min 內(nèi)注射完畢。注畢后立即將大鼠直立1 min,防止大鼠嗆咳。一旦大鼠出現(xiàn)呼吸心跳暫停,立即行心臟按壓并機(jī)械通氣,防止窒息死亡。逐層縫合頸部切口,電熱毯復(fù)溫加速大鼠蘇醒。待大鼠蘇醒后正常飼養(yǎng)。造模后6 h、12 h、24 h LPS 組和SW 組隨機(jī)各抽取4 只大鼠,麻醉后取靜脈血、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）及肺組織,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Control 組4只大鼠一次性進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 血清IL-1、IL-6、TNF-α 濃度測(cè)定:分別于建模后6 h、12 h、24 h 抽取大鼠下腔靜脈血3 mL,常溫靜置4～6 h,離心取上清液,按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清IL-1、IL-6、TNF-α 濃度。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）IL-1、IL-6、TNF-α 濃度測(cè)定:夾閉左肺門(mén),以3 mL 無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗右肺獲取肺泡灌洗液2 mL,離心取上清液,采用ELISA 試劑盒測(cè)定IL-1、IL-6、TNF-α 濃度及總蛋白濃度。

1.3.4 肺組織濕重/干重比值:取大鼠左肺下葉,吸水紙擦拭組織表面稱(chēng)重為濕重,脫水后烤箱烘干,反復(fù)稱(chēng)量至重量不再發(fā)生變化為干重,計(jì)算濕重/干重比值。

1.3.5 病理組織HE 染色:取左肺上葉,PBS 液沖洗后制作病理切片,行HE 染色,觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 14.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以±s 表示,單因素兩組間比較,使用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）;若方差齊兩組間比較采用LSD 檢驗(yàn);若方差不齊則用Dunnett’s t3進(jìn)行校正。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 肺組織損傷及病理改變 HE 染色切片顯示,Control 組大鼠肺組織肺泡壁較薄,相對(duì)完整,偶見(jiàn)肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞,中性粒細(xì)胞極少見(jiàn)（圖1A、1B）。造模后6 h LPS 組和SW 組大鼠可見(jiàn)肺組織片狀損傷,中性粒細(xì)胞聚集,仍有部分肺組織正常,LPS 組和SW組之間未見(jiàn)明顯差異（圖1C、1F）。造模后12 h LPS組和SW 組均可見(jiàn)較明顯的肺泡斷裂、間質(zhì)輕微增厚以及較多中性粒細(xì)胞聚集（圖1D、1G）。造模后24 h LPS 組和SW 組均可見(jiàn)明顯的肺泡萎陷、破裂,肺泡壁及間質(zhì)增厚,中性粒細(xì)胞滲出及巨噬細(xì)胞增多,并伴有纖維蛋白鏈沉積和透明膜形成,表現(xiàn)為急性肺損傷病理學(xué)改變（圖1E、1F,圖2）。

圖1 各組肺組織HE 染色病理學(xué)表現(xiàn)（200×）

圖2 急性肺損傷組織（400×）

2.2 各組血清及肺泡灌洗液中IL-1、IL-6、TNF-α濃度比較 造模后6 h、12 h、24 h LPS 組和SW 組血清IL-1 濃度高于Control 組,造模后6 h LPS 組血清IL-6 及TNF-α 濃度高于Control 組,SW 組IL-6濃度高于Control 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。造模后6 h、12 h、24 h LPS 組和SW 組BALF中TNF-α 和IL-6 濃度高于Control 組,造模后12 h、24 h LPS 組BALF 中IL-1 濃度高于Control 組,造模后24 h SW 組BALF 中IL-1 濃度高于Control組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。若同時(shí)考慮血清和肺泡灌洗液中3 種炎癥因子的表達(dá)情況,LPS 組在12 h 便出現(xiàn)了3 種炎癥因子同時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高,而SW 組則是24 h 才同時(shí)出現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。LPS 組與Control 組比較,血液或是BALF 中,LPS 組促炎因子濃度均高于SW 組,但僅僅是血液中TNF-α 在6 h 節(jié)點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,BALF 中IL-6 在6 h、12 h 節(jié)點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

表1 各組血清中炎癥因子濃度比較 pg/mL

表2 各組BALF 中炎癥因子濃度比較 pg/mL

圖3 LPS 和SW 兩組大鼠血清及BALF 中炎癥因子變化（*P＜0.05）

2.3 各組肺泡灌洗液中總蛋白含量比較 肺泡上皮和血管通透性增加引起血管外蛋白積累,肺泡灌洗液中總蛋白含量可反映毛細(xì)血管屏障破壞的程度。造模后6 h、12 h、24 h 3 組肺泡灌洗液中總蛋白含量比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠BALF 中總蛋白含量

2.4 各組大鼠肺組織濕重/干重比較 計(jì)算肺組織濕重/干重比是測(cè)量肺水量的粗略方法,間接反映肺毛細(xì)血管和肺泡上皮細(xì)胞滲透率改變。造模后6 h、12 h、24 h LPS 組及SW 組肺組織濕重/干重比大于Control 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。造模后各時(shí)間點(diǎn)LPS 組肺組織濕重/干重比大于SW 組,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠肺組織濕重/干重比較

3 討論

ALI 作為死亡率很高的危重癥,對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究任重而道遠(yuǎn)。而動(dòng)物模型的建立與評(píng)估在基礎(chǔ)研究中起著不可替代的作用。目前已建立多種ALI動(dòng)物模型,但尚不完全符合人類(lèi)ALI 發(fā)病特點(diǎn),盡管如此,人類(lèi)對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)以及藥物作用機(jī)制研究依然離不開(kāi)現(xiàn)有的動(dòng)物模型。鑒于美國(guó)胸科委員會(huì)提出的肺損傷評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[14],我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件以及普適性選擇相應(yīng)指標(biāo)及測(cè)量方法來(lái)評(píng)估ALI 動(dòng)物模型。（1）通過(guò)組織切片HE 染色尋找肺組織損傷證據(jù);（2）測(cè)定BALF 中總蛋白含量及肺組織濕重/干重比評(píng)估肺泡毛細(xì)血管屏障改變;（3）測(cè)定血清及BALF 以及血清中促炎癥細(xì)胞因子濃度評(píng)估肺部炎癥反應(yīng)。

本研究選擇最方便且準(zhǔn)確性最高的氣管穿刺入路,LPS 和海水建立的大鼠ALI 模型代表缺氧和內(nèi)毒素兩種因素導(dǎo)致的肺損傷,可以覆蓋臨床上大多直接肺損傷類(lèi)型。我們發(fā)現(xiàn)這兩種模型均可見(jiàn)明顯的肺組織損傷和炎癥反應(yīng),與已知的ALI 可能發(fā)生機(jī)制吻合。本研究結(jié)果顯示,LPS 組和SW 組大鼠血清和BALF 中炎癥因子水平以及肺組織濕重/干重比均顯著高于Control 組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而肺泡灌洗液中蛋白質(zhì)含量在3 組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這或許是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的滲出會(huì)滯后于炎癥介質(zhì)的出現(xiàn)和肺水腫的形成。而LPS 與SW 組比較,血液或是BALF 中,LPS 組3 種炎癥因子濃度均高于SW組,但僅僅是血液中TNF-α 在6 h 節(jié)點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,BALF 中IL-6 在6 h、12 h 節(jié)點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并不能說(shuō)明LPS 組的炎癥反應(yīng)比SW 組重。但是若同時(shí)考慮血漿和肺泡灌洗液中3 種炎癥因子的表達(dá)情況,LPS 組在12 h 便出現(xiàn)了3 種炎癥因子同時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高,而SW 組則是24 h 才出現(xiàn)該現(xiàn)象。因此,通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可知,LPS 及SW 誘導(dǎo)的動(dòng)物模型均可模擬ALI 疾病狀態(tài),但其炎癥因子升高的時(shí)間點(diǎn)各有不同,LPS 誘導(dǎo)的ALI 比SW誘導(dǎo)的ALI 炎癥反應(yīng)發(fā)生的更迅速。

綜上所述,本研究采用的LPS 和海水誘導(dǎo)的ALI 動(dòng)物模型均具有普適性,可重復(fù)性強(qiáng),簡(jiǎn)單直接等優(yōu)點(diǎn),非常適用于條件有限的實(shí)驗(yàn)室研究。且本研究對(duì)兩種肺損傷動(dòng)物模型病理生理的改變進(jìn)行了多方面的比較與評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),LPS 及SW 均可成功誘導(dǎo)ALI,但其炎癥因子升高的時(shí)間點(diǎn)各有不同,如血液中或是BALF 中,LPS 組大鼠TNF-α 的濃度最先出現(xiàn)有意義的升高,而在SW 組中卻是IL-6 率先出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高,且LPS 誘導(dǎo)的ALI 比SW誘導(dǎo)的ALI 炎癥反應(yīng)發(fā)生的更迅速。這對(duì)我們后續(xù)疾病的研究具有指導(dǎo)意義,如動(dòng)物模型選擇、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、藥物干預(yù)時(shí)間、標(biāo)本獲取時(shí)間、不同機(jī)制研究等。