楊 杰，劉 超，段程偉

（1 南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院/南通市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 226006；2 蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；3 南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院/南通市第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心）

小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的共同特征[1]。β1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-1（beta 1,4-galactosyltransferase I,β4GalT1）是一種糖基轉(zhuǎn)移酶[2],參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展[3],在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。既往研究大多側(cè)重β4GalT1 對細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控,尚不清楚該酶是否通過調(diào)節(jié)底物N-糖基化修飾而參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化。CD200R 是I 型跨膜糖蛋白,有CD200R1、CD200R2、CD200R3 和CD200R4 四種亞型,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CD200R1 主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞,是CD200 的受體,CD200 主要表達(dá)于神經(jīng)元表面[4]。CD200 與CD200R 結(jié)合能使小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)[5]。當(dāng)CD200-CD200R 結(jié)合異常時,小膠質(zhì)細(xì)胞活化增加,引起神經(jīng)元損傷[6]。本研究分析β4GalT1 對CD200R1 N-糖基化的調(diào)節(jié)及其在小膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化和神經(jīng)元損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞模型 采用小鼠BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞株和人源胚胎腎細(xì)胞（HEK239T 細(xì)胞）（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）,加入DMEM 完全培養(yǎng)基（Thermo,11965092,含10%FBS、100 U/mL 青毒素、100 U/mL 鏈霉素）,置于5%CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng) 在生物安全柜內(nèi)以75%酒精浸泡消毒,快速取出小鼠腦組織,以4 ℃預(yù)冷D-Hank 液沖洗,仔細(xì)剝離腦膜、血管。將腦組織置于D-Hank 液中剪碎,放入15 mL 離心管中,加入等量D-Hank 液和0.25%胰酶（Sigma,T4049）,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)8 min,每隔3 min 搖晃1 次使消化完全。取出培養(yǎng)瓶,加入適量DMEM 完全培養(yǎng)基以終止消化。500 r/min 離心5 min,棄去上清液,加入適量DMEM 完全培養(yǎng)基,吸管反復(fù)吹打30 次使細(xì)胞呈懸濁狀,靜置5 min,留取上清液,400 目濾網(wǎng)過濾。將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶,細(xì)胞濃度5×105/cm3,置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h 后培養(yǎng)基更換為神經(jīng)元培養(yǎng)液,3 d 后換全液,依細(xì)胞生長情況,每3～4 d 換半液。

1.3 β4GalT1 和CD200R1 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 pcDNA3.1myc-β4GalT1 表達(dá)載體已由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。CD200R1 表達(dá)載體構(gòu)建:從相關(guān)網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）獲取小鼠CD200R1基因mRNA 序列,利用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)Flag-CD200R1 載體上下游引物,sense:5＇-CGGAATTCAATGTTTTGCTTTTGGAGA-3＇,antisense:5＇-GGGGTACCAGATTCCAATGGCCGAC-3＇,分別含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)。引物由上海鉑尚生物科技有限公司合成。提取小鼠皮層制備RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA,利用PCR 反應(yīng)結(jié)合上述全長引物,擴(kuò)增CD200R1 的全長cDNA,然后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和Sanger 法測序鑒定構(gòu)建Flag-CD200R1 載體。隨后根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書,采用瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 運(yùn)用ELISA 試劑盒（Abcam 公司）檢測BV2 細(xì)胞中炎癥因子iNOS、CD86、IL-1β、TNF-α 的表達(dá),按試劑盒說明操作。將濃縮洗滌液稀釋至工作濃度,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至所需濃度,混勻后靜置20 min。臨用前將濃縮的生物素化抗體用稀釋液按比例稀釋,配制成抗體工作液。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入ELISA 板條相應(yīng)孔中,100 μL/孔。封板紙遮蔽孔位,37 ℃恒溫箱中靜置90 min,洗板3次。每孔滴加生物素化抗體工作液100 μL,封板紙遮蔽孔位,37 ℃恒溫箱中靜置60 min,洗板3 次。每孔滴加酶結(jié)合物工作液100 μL,用封板紙遮蔽孔位,37 ℃恒溫箱中靜置30 min,洗板3 次。每孔滴加顯色液100 μL,37 ℃恒溫箱中避光靜置10～15 min。最后多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光值?？瞻卓撞蛔魅魏翁幚?。

1.5 Western Blot （1）配制膠板;（2）樣品處理:蛋白樣品于恒溫金屬浴中37 ℃解凍,13 000 g,4 ℃離心1 min,置于冰上;（3）上樣:將樣品加入上樣孔,110 V 電泳70 min 左右;（4）轉(zhuǎn)膜:采用PVDF 膜,恒流300 mA 轉(zhuǎn)膜90 min;（5）封閉:5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜2 h;（6）一抗孵育:按照相應(yīng)稀釋比用一抗稀釋液稀釋抗體,置于4 ℃冰箱孵育過夜;（7）二抗孵育:洗膜3 次,每次10 min。將膜置于稀釋好的二抗中,室溫孵育2 h;（8）顯影:洗膜3 次,ECL 顯影,采用圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.6 免疫共沉淀 以中效RIPA 裂解液[含50 mmol/L Tris（pH 7.4）,150 mmol/L NaCl,1%NP-40,0.5%脫氧膽酸鈉,0.1%SDS,1×protease inhibitor cocktail 和1×phosphatase inhibitor cocktail]裂解細(xì)胞,15 000 g,4 ℃離心20 min,吸取上清。取20 μL 上清液作為Input,其余上清液以磁性的protein A/G beads 預(yù)澄清后分為均等的3 份,分別加入對照IgG、抗myc 和Flag 抗體,4 ℃孵育輪轉(zhuǎn)過夜。加入30～40 μL 磁性protein A/G 珠,繼續(xù)4 ℃孵育輪轉(zhuǎn)過夜。以中效RIPA 裂解液洗滌5 次,加入20 μL 1×SDS-PAGE 上樣緩沖液,以Western Blot 法檢測myc 和flag 相互結(jié)合情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0 和Sigma Plot 10.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s 表示,兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β4GalT1 與CD200R1 在HEK239T 細(xì)胞中存在相互作用 將myc-β4GalT1 和Flag-CD200R1 野生型全長質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T 細(xì)胞內(nèi),免疫共沉淀結(jié)合Western Blot 技術(shù)發(fā)現(xiàn)β4GalT1 與CD200R1 存在相互作用（圖1）。

圖1 β4GalT1 與CD200R1 在HEK239T 細(xì)胞中存在相互作用

2.2 β4GalT1 與CD200R1 在BV2 細(xì)胞中存在相互作用 將myc-β4GalT1 和flag-CD200R1 野生型全長質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入BV2 細(xì)胞中,免疫共沉淀結(jié)合Western Blot 技術(shù)發(fā)現(xiàn)β4GalT1 和CD200R1 也存在相互作用（圖2A）,細(xì)胞免疫熒光檢測顯示在正常組和LPS 處理組中,β4GalT1 和CD200R1 共定位于細(xì)胞膜（圖2B）。

圖2 β4GalT1 與CD200R1 在BV2 細(xì)胞中存在相互作用

2.3 β4GalT1 調(diào)節(jié)CD200R1 N-糖基化修飾 免疫共沉淀和凝集素（RCA-1）印跡技術(shù)檢測結(jié)果表明,CD200R1 的N-糖鏈含有β-1,4-糖苷鍵（圖3A,3B）。BV2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染myc-β4GalT1 或si-β4GalT1 后,顯示β4GalT1 對CD200R1 的N-糖基化有調(diào)節(jié)作用（圖3A,3B）。本實(shí)驗(yàn)顯示44 號位突變后糖鏈表達(dá)減弱（圖3C,3D）,表明CD200R1 存在著N-糖基化修飾,β4GalT1 參與CD200R1 的N-糖基化。

圖3 β4GalT1 調(diào)節(jié)CD200R1 的N-糖基化修飾

2.4 N44Q 不改變CD200R1 的細(xì)胞定位 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CD200R1 44 號位糖基化位點(diǎn)與CD200-CD200R1 的結(jié)合有關(guān),為進(jìn)一步研究該位點(diǎn)對CD200R1 的影響,我們在BV2 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染flag 標(biāo)記的野生型CD200R1（wtCD200R1）和N44Q 24 h 后,使用免疫熒光顯微鏡檢測外源性wtCD200R1和N44Q 的定位,顯示野生型組和突變組中CD200R1 定位均未發(fā)生改變（圖4）。

圖4 44 號位突變前后CD200R1 細(xì)胞定位

2.5 N44Q 突變促進(jìn)BV2 細(xì)胞炎性活化 在培養(yǎng)的BV2 細(xì)胞中加入CD200Fc 與CD200R1 結(jié)合,選擇性轉(zhuǎn)染myc-β4GalT1、wtCD200R1 和N44Q 突變體,LPS 處理后收集各組培養(yǎng)上清液,ELISA 檢測顯示,iNOS、CD86、IL-1β、TNF-α 炎性細(xì)胞因子的表達(dá)受到抑制,而轉(zhuǎn)染N44Q 突變體則促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)（圖5）。表明CD200Fc-CD200R1 抑制炎性細(xì)胞因子的釋放,此過程有CD200R1 的N-糖基化44號位的參與,β4GalT1 對CD200R1 糖基化修飾抑制炎性因子的釋放。

圖5 在CD200-CD200R1 體系中N44Q 促進(jìn)BV2 炎癥活化

2.6 N44Q 突變促進(jìn)神經(jīng)元損傷 為進(jìn)一步研究CD200R1 的N-糖基化修飾對BV2 細(xì)胞活化后釋放神經(jīng)毒性的影響,在BV2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染myc-β4GalT1、wtCD200R1 及N44Q 突變體,LPS（100 ng/mL）刺激后加入神經(jīng)元,采用LDH 試劑盒檢測神經(jīng)元損傷情況。在上述各野生型組和突變組BV2 細(xì)胞中加入神經(jīng)元,結(jié)果顯示加入anti-CD200 抗體后,野生型組神經(jīng)元損傷增加。在突變組加入神經(jīng)元共培養(yǎng)后,進(jìn)一步加入anti-CD200 抗體后,神經(jīng)元損傷無明顯變化（圖6）。

圖6 N44Q 突變對神經(jīng)元損傷的影響

3 討論

當(dāng)機(jī)體處于正常狀態(tài)時,小膠質(zhì)細(xì)胞維持靜息狀態(tài),當(dāng)處于疾病狀態(tài)時,小膠質(zhì)細(xì)胞被誘導(dǎo)活化,通過分泌IL-1β、TNF-α、TGF-β 等細(xì)胞因子促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬破碎細(xì)胞和變性髓鞘,對機(jī)體有益[8]。但當(dāng)機(jī)體免疫狀態(tài)異常時,小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)活化并分泌細(xì)胞因子和氧自由基,促使神經(jīng)元損傷[9]。因此,小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中發(fā)揮雙相作用。

β4GalT1 是研究最廣泛的一種糖基轉(zhuǎn)移酶,分為長型和短型兩種,短型β4GalT1 與β-1,4-半乳糖苷鍵（Galβ1-4GlcNAc）的形成有關(guān)。本文研究短型β4GalT1,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β4GalT1 和CD200R1存在相互作用,且參與調(diào)節(jié)CD200R1 的N-糖基化。CD200R1 廣泛表達(dá)于包括小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的髓系細(xì)胞表面,CD200 則廣泛表達(dá)于神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。研究表明,阻斷CD200-CD200R1 結(jié)合能增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性活化和神經(jīng)元損傷[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CD200R1 存在N 糖基化修飾,且44 號位糖基化扮演重要角色[7]。本文結(jié)果顯示,CD200R1 的44號位點(diǎn)N-糖基化修飾對CD200-CD200R 的結(jié)合十分重要,去除該位點(diǎn)的N-糖基化將削弱CD200R1 與CD200 的結(jié)合。在LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥活化模型中,發(fā)現(xiàn)使用抗CD200 抗體阻斷CD200 與CD200R 結(jié)合,可上調(diào)炎癥因子的表達(dá),去除CD200R1 的44 號位點(diǎn)N-糖基化也呈現(xiàn)相似的效應(yīng),同時增強(qiáng)對神經(jīng)元的損傷。本研究通過選擇性調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化,為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病提供潛在藥物設(shè)計(jì)和治療靶點(diǎn)。