譚曉, 黃建, 劉向東

湖北民族大學附屬民大醫(yī)院重癥醫(yī)學科,湖北恩施 445000

膿毒癥是感染引起的器官功能障礙綜合征,腎損傷是其常見的并發(fā)癥,也是導致膿毒癥患者死亡的主要原因[1]。炎癥、氧化應激、凋亡、自噬、非編碼RNA異常表達等與膿毒癥腎損傷的發(fā)生發(fā)展關系密切[2]。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/絲氨酸蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase,Akt)信號軸可調控細胞氧化應激、炎癥、凋亡、自噬,且PI3K/Akt通路活化也參與膿毒癥及腎損傷過程[3-4]。PI3K/Akt通路在膿毒癥腎損傷病理過程中的調控作用還存在爭議。研究報道,微小RNA(microRNA,miRNA)異常表達與膿毒癥的發(fā)生有關[5]。miRNA中的miR-124在膿毒癥腎損傷模型大鼠腎臟中處于低表達水平[6],提示miR-124可能與膿毒癥腎損傷關系密切。本研究通過建立大鼠膿毒癥腎損傷模型,探討miR-124基于PI3K/Akt信號軸對膿毒癥腎損傷的影響,為膿毒癥腎損傷的靶向治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 動物、試劑及儀器

72只SPF級雄性SD大鼠6～7周齡,體質量200～220 g,購自北京北方艾特生物科技有限公司,生產許可證號為SCXK(京)2020-0005。本動物實驗符合3R原則并經本院倫理委員會批準。

HE染色及TUNEL細胞凋亡試劑盒(上海吉至生化科技有限公司);miR-124激動劑(miR-124-agomir)及其陰性對照(agomir-NC)(艾博思生物);TRIzol試劑盒及qRT-PCR試劑盒(美國賽默飛公司);PI3K/Akt抑制劑(LY294002)(北京百奧萊博科技有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(B cell lymphoma-2 assaciated X protein,Bax)、Caspase-3、核轉錄因子(nuclear factor,NF)-κB p65及其磷酸化NF-κB p65(p-NF-κBp65)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白等抗體(美國abcam公司);谷胱甘肽過氧化氫酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)(上海彩佑實業(yè)有限公司)。

1.2 大鼠膿毒癥腎損傷模型建立及分組

將72只SD大鼠均分為假手術組(不做任何處理)、模型組(造模成功后不做任何處理)、miR-124-agomir組(miR-124高表達腺病毒載體處理)、agomir-NC組(陰性對照空載體處理)、LY294002組(PI3K/AKT抑制劑處理)、miR-124-agomir+LY294002組(miR-124高表達腺病毒載體和PI3K/AKT抑制劑處理)。除假手術組外,其余各組均采用盲腸結扎穿刺法建立膿毒癥腎損傷模型[7],并于造模成功后按各組相應給藥處理。假手術組、模型組不做任何處理;miR-124-agomir組、agomir-NC組分別尾靜脈注射50 μL/kg miR-124高表達腺病毒載體和陰性對照空載體混懸液,并腹腔注射等體積生理鹽水[8];LY294002組腹腔注射10 mL/kg PI3K/AKT抑制劑LY294002;miR-124-agomir+LY294002組尾靜脈注射miR-124高表達腺病毒載體和腹腔注射PI3K/AKT抑制劑LY294002;各組連續(xù)給藥3天,每天1次。

1.3 大鼠行為學及腎功能觀察

各組大鼠均于給藥期間觀察行為學變化,并統(tǒng)計死亡情況。于末次給藥結束12 h后,取各組大鼠血清按照試劑盒檢測腎功能指標肌酐(creatinine,Cr)及尿素氮(urea nitrogen,BUN)水平。

1.4 HE法檢測腎組織病理變化

各組大鼠取血后,斷頭處死,取出左右兩腎,右腎組織置于-80 ℃冰箱保存,左腎置于4%多聚甲醛中固定24 h后,進行常規(guī)透明、浸蠟、包埋處理后切成5 μm切片,取部分切片,按蘇木精-伊紅染色試劑盒說明書染色后置于鏡下觀察。

1.5 TUNEL法檢測腎組織細胞凋亡

組織切片進行二甲苯清洗、梯度乙醇脫水、蛋白酶K及過氧化氫處理后,按TUNEL檢測試劑盒說明書方法,滴加TUNEL反應液進行顯色封片后置于顯微鏡下觀察細胞凋亡情況,每張切片隨機選取5個視野,計算細胞凋亡率。細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目×100%。

1.6 qRT-PCR檢測大鼠腎組織miR-124相對表達水平

腎組織于4 ℃冰箱中解凍后,按TRIzol試劑盒說明書取總RNA,再以總RNA為模板,反轉錄cDNA,反轉錄后依照qRT-PCR試劑盒(SYBR Green)說明書及PCR儀擴增。96 ℃ 110 s,96 ℃ 40 s、55～60 ℃ 40 s、76 ℃ 40 s,45個循環(huán);76 ℃ 260 s后終止反應。miR-124以U6為內參,采用2-ΔΔCt算法計算miR-124相對表達水平。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,miR-124正向引物為5′-CACTCCAGCTGGGTAAGGCAACGCGGT-3′,反向引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′;U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.7 Western blotting法檢測腎組織氧化應激、炎癥、凋亡和PI3K/Akt、Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達

取保存的腎組織,4 ℃冰箱解凍后剪取200 mg,用細胞核蛋白及漿蛋白抽提試劑盒說明書方法,提取細胞核中蛋白及細胞質中蛋白,取各組上清液按BCA試劑盒說明書操作測各組蛋白水平,取60 μg蛋白進行電泳、轉膜后,室溫下封閉1 h后,加入一抗PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、SOD、GSH-Px、Bax、Caspase-3、NF-κB、p-NF-κB、TNF-α、Nrf2、HO-1(1∶1 500)、β-actin及Lamin B內參抗體(1∶3 000),4 ℃搖床孵育過夜并加入羊抗兔二抗(1∶2000),在37 ℃條件下孵育1 h后,用增強化學發(fā)光法顯色,以化學發(fā)光儀觀察條帶并拍照,并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達水平。其中除Nrf2檢測細胞核中蛋白表達外,其余均檢測細胞質中總蛋白表達。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠腎組織病理結果比較

假手術組大鼠飲食活動正常,無死亡。模型組、miR-124-agomir組、LY294002組、agomir-NC組、miR-124-agomir+LY294002組大鼠死亡分別為3、1、6、2、2只。HE染色結果顯示,假手術組大鼠腎小球、腎小管結構正常;模型組大鼠腎小管上皮細胞腫脹及空泡變性嚴重,腎間質炎癥細胞浸潤明顯;miR-124-agomir組大鼠腎小管空泡變性較輕,炎癥細胞浸潤較模型組減輕;LY294002組大鼠腎小管空泡變性及炎癥細胞浸潤較模型組進一步加重;miR-124 agomir+LY294002組及agomir-NC組腎組織上述病理損傷程度與模型組相近(圖1)。

圖1 各組大鼠腎組織病理結果(HE染色,400×)A為假手術組;B為模型組;C為agomir-NC組;D為miR-124-agomir組;E為LY294002組;F為miR-124-agomir+LY294002組。

2.2 各組大鼠腎功能指標的比較

與假手術組比較,其他各組Cr和BUN水平升高(P<0.05);與模型組比較,miR-124-agomir組Cr和BUN水平降低(P<0.05),LY294002組升高(P<0.05)。與miR-124-agomir組比較,miR-124-agomir+LY294002組Cr和BUN水平升高(P<0.05;表1)。

表1 各組大鼠腎功能指標比較 μmol/L

2.3 各組大鼠腎組織細胞凋亡的比較

與假手術組比較,其他各組細胞凋亡率升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124-agomir組細胞凋亡率降低(P<0.05),LY294002組升高(P<0.05)。與miR-124-agomir組比較,miR-124-agomir+LY294002組細胞凋亡率升高(P<0.05;圖2)。

圖2 大鼠腎組織TUNEL染色圖(200×)和細胞凋亡水平A為假手術組;B為模型組;C為agomir-NC組;D為miR-124-agomir組;E為LY294002組;F為miR-124-agomir+LY294002組。a為P<0.05,與假手術組比較;b為P<0.05,與模型組比較;c為P<0.05,與miR-124-agomir組比較。

2.4 各組大鼠抗氧化應激相關蛋白比較

與假手術組比較,模型組SOD、GSH-Px蛋白表達降低(P<0.05),Nrf2及HO-1升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124-agomir組SOD、GSH-Px、Nrf2及HO-1升高(P<0.05);而LY294002組各指標降低(P<0.05)。與miR-124-agomir組比較,miR-124-agomir+LY294002組上述各指標降低(P<0.05;圖3、表2)。

表2 各組大鼠SOD、GSH-Px、Nrf2、HO-1蛋白表達比較

圖3 各組蛋白表達免疫印跡圖A為假手術組;B為模型組;C為miR-124-agomir組;D為LY294002組;E為miR-124-agomir+LY294002組;F為agomir-NC組。

2.5 各組大鼠腎組織炎癥及凋亡相關蛋白表達的比較

與假手術組比較,模型組miR-124表達降低,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-NF-κBp65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3表達升高(P<0.05)。與模型組比較,miR-124-agomir組miR-124、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達升高,p-NF-κBp65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3表達降低(P<0.05);LY294002組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達降低,p-NF-κB p65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3升高(P<0.05)。與miR-124-agomir組比較,miR-124-agomir+LY294002組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達降低(P<0.05),p-NF-κBp65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3表達升高(P<0.05;圖4、表3)。

表3 各組大鼠腎組織p-NF-κBp65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3蛋白表達比較

圖4 各組大鼠腎組織p-NF-κBp65/NF-κBp65、TNF-α、Bax、Caspase-3蛋白表達免疫印跡圖A為假手術組;B為模型組;C為miR-124-agomir組;D為LY294002組;E為miR-124-agomir+LY294002組;F為agomir-NC組。

3 討 論

膿毒癥具有較高的發(fā)病率及死亡率,全世界每年將近70%患者因患膿毒癥急性腎損傷而死亡[9-11]。

嚴重的炎癥反應是膿毒癥的主要病理特征,而腎臟為最易受炎癥因子攻擊的靶器官之一[12]。Fu等[13]發(fā)現(xiàn),膿毒癥早期最先釋放的炎癥因子TNF-α可引起炎癥而進一步導致腎功能損傷,表現(xiàn)為血清Cr、BUN的持續(xù)升高。本研究用盲腸結扎穿刺法建立膿毒癥大鼠模型后,發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)死亡,血清Cr、BUN異常升高,并伴隨腎組織病理損傷,TNF-α、p-NF-κB/NF-κB表達異常升高,提示膿毒癥腎損傷模型造模成功。本研究結果顯示,抗氧化因子SOD及GSH-Px表達在模型大鼠腎組織中表達降低,且腎組織細胞凋亡率及凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達異常高于假手術組,提示氧化應激及細胞凋亡也可能參與膿毒癥腎損傷過程。

研究證實,miRNA可調節(jié)靶基因表達,參與炎癥、氧化應激、細胞凋亡等過程,且與膿毒癥腎損傷的發(fā)生關系密切[14-15]。Li等[6]在膿毒癥模型大鼠腎組織中檢測到miR-124表達下調。膿毒癥血清中氧化物酶體增殖物激活受體γ升高會上調miR-124表達來抑制炎癥反應[16]。本研究模型組大鼠腎組織miR-124表達異常降低,過表達miR-124后,大鼠死亡減少,腎功能障礙、腎組織炎性損傷、氧化應激、凋亡等明顯較模型組改善,證實過表達miR-124可緩解膿毒癥腎損傷進程。但miR-124的調控作用還需進一步研究。

PI3K/Akt通路是調控炎癥、氧化應激、細胞凋亡的關鍵通路之一[3,17]。本研究模型組大鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達升高,而抑制PI3K/Akt通路活化后,大鼠死亡率增加,腎組織炎癥、氧化應激、腎組織損傷及腎功能障礙也進一步加重。另外,在炎癥因子及氧化應激刺激下,PI3K激活可通過磷酸化Akt,促進Akt下游傳輸信號蛋白Nrf2表達及入核活化,清除過氧化物蓄積及減少TNF-α等炎癥因子分泌,而PI3K/Akt/Nrf2/HO-1途徑活化受miR-124的間接調控[18]。本研究結果顯示,miR-124過表達可活化PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路,提示miR-124可激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1途徑活化降低膿毒癥腎損傷,而這一作用可被PI3K/Akt通路抑制劑LY294002逆轉。

綜上所述miR-124可能通過激活PI3K/Akt通路發(fā)揮抗炎癥、抗氧化、抗凋亡作用,改善膿毒癥大鼠腎損傷進程。但膿毒癥過程中還會引起肺、肝等器官的損傷,miR-124是否還靶向作用于肺、肝器官損傷而延緩膿毒癥進程還需進一步研究。