張學(xué)武, 鄭茜玲, 劉繼華

1.北京大學(xué)第三醫(yī)院延安分院 延安市中醫(yī)醫(yī)院口腔科,陜西延安 716000;2.西安大興醫(yī)院耳鼻喉科,陜西西安 710016

口腔癌是發(fā)生在口腔部位的癌癥,也是較常見(jiàn)的腫瘤之一[1],最常見(jiàn)的病理類(lèi)型為鱗狀細(xì)胞癌,約占口腔癌總體的90%[2]。因其發(fā)病部位較為隱蔽,發(fā)現(xiàn)時(shí)大多處于中晚期,故死亡率高,預(yù)后差[3]。研究表明,口腔癌的發(fā)生與長(zhǎng)期嚼檳榔、吸煙等不良習(xí)慣有關(guān)[4]。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)可對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)生正向或負(fù)向的影響,進(jìn)一步改變腫瘤的進(jìn)展[5]。研究表明,miR-409-5p在癌癥中高表達(dá)[6]。本文探討下調(diào)miR-409-5p對(duì)口腔癌細(xì)胞增殖、遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器

收集本院確診并手術(shù)的8例口腔癌患者的口腔癌組織及癌旁正常組織。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療、靶向或內(nèi)分泌等輔助治療。患者均簽署知情同意書(shū)。qRT-PCR檢測(cè)癌組織與癌旁正常組織中miR-409-5p水平。人口腔鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系GNM、人口腔癌細(xì)胞SCC25、SCC-9、HN6購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù),RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,miRNA inhibitor、陰性對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪基因有限責(zé)任公司,vimentin、β-actin一抗購(gòu)于江蘇親科生物研究中心有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人口腔癌癌細(xì)胞GNM、SCC25、SCC-9、HN6均于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到培養(yǎng)皿80%選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀態(tài)較好的SCC-9細(xì)胞株種于六孔板,待密度達(dá)到60%根據(jù)轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。篩選出確定細(xì)胞株后,按照對(duì)細(xì)胞的不同處理,將細(xì)胞分為3組:空白對(duì)照組(Lip2000處理的SCC-9細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(Lip2000+陰性對(duì)照序列處理SCC-9細(xì)胞)、miR-409-5p組(Lip2000和inhibitor-miR-409-5p共同處理SCC-9細(xì)胞)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)GNM、SCC25、SCC-9、HN6細(xì)胞中miR-409-5p的表達(dá)

以人口腔鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系GNM作為對(duì)照,使用qRT-PCR篩選人口腔鱗癌細(xì)胞(SCC25、SCC-9、HN6)中miR-409-5p相對(duì)表達(dá)量最高的細(xì)胞株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。取接種于6孔板的4組細(xì)胞,在5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí),棄培養(yǎng)基,每孔加入1 mL TRIzol,轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的離心管中,加入氯仿200 μL,震蕩15 min,室溫靜置15 min,4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上層液體加入等體積異丙醇,12 000 r/min離心5 min。去上清液,加入75%乙醇1 mL,12 000 r/min離心5 min。去上清液,管內(nèi)沉淀靜置干燥5 min,加入焦碳酸二乙酯水溶解,分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA溶液水平,重復(fù)檢測(cè)3次。各組細(xì)胞提取RNA后,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄條件37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,反應(yīng)條件95 ℃10 min 1個(gè)循環(huán);95 ℃5 s,60 ℃1 min 40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min 1個(gè)循環(huán)。miR-409-5p正向引物:5′-AUGCAAAGUUGCUCGG GUAACCU-3′,反向引物:5′-CCAUCAGUCCCAAAU CCA-3′;GAPDH正向引物:5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,反向引物:5′-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3′。以GNM細(xì)胞為對(duì)照,比較各細(xì)胞miR-409-5p的相對(duì)表達(dá)量,選取miR-409-5p表達(dá)最高的作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

1.5 MTT法檢測(cè)SCC-9細(xì)胞增殖情況

取空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-409-5p組細(xì)胞以每孔1×104的細(xì)胞數(shù)種植于96孔板,每組設(shè)置5個(gè)副孔,放入細(xì)胞恒溫箱培養(yǎng)24 h后,以每孔15 μL加入四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)溶液,放入37 ℃溫箱孵育4 h,加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),30 min后測(cè)定490 nm波長(zhǎng)光密度(optical density,OD)。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)×100%,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力

遷移實(shí)驗(yàn):取空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-409-5p組細(xì)胞以每孔數(shù)為2×105個(gè)加入小室中,每組細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔。使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸于上室中,下室加入600 μL含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后取出,觀察細(xì)胞狀態(tài),棉簽擦除未穿小室膜細(xì)胞后,PBS清洗2次,置于4%多聚甲醛溶液中固定15 min后,取出風(fēng)干后置入結(jié)晶紫溶液中,浸泡10 min后再次清洗,再次風(fēng)干后顯微鏡下拍照。侵襲實(shí)驗(yàn):將基質(zhì)膠原液用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后以50 μL/孔加入小室上層中,注意不要產(chǎn)生氣泡。放置恒溫培養(yǎng)箱2 h,待基質(zhì)膠凝固后重復(fù)遷移實(shí)驗(yàn)步驟。

1.7 Western blotting法檢測(cè)vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量

各組細(xì)胞消化離心,在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min,棄上清液,PBS清洗后細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min后4 ℃過(guò)夜,次日離心30 min,取上清液。BCA試劑盒檢測(cè)各組蛋白水平。3組蛋白取等量樣品進(jìn)行凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后,快速封閉液封閉30 min,加入一抗稀釋液進(jìn)行孵育,4 ℃條件下?lián)u床搖晃過(guò)夜。次日四聚丙烯(烷基)苯磺酸鹽溶液清洗后加入二抗(山羊抗兔1∶5 000)稀釋液孵育2 h,ECL試劑盒曝光顯影。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)vimentin mRNA

各組細(xì)胞消化離心,PBS洗滌,離心5 min(1 500 g/min,4 ℃),取下層沉淀,依次加入1 mL TRIzol試劑、0.2 mL氯仿試劑,混勻后冰浴10 min,離心(12 000 r/min,4 ℃)15 min后取上清,加入1 mL異丙醇,冰浴半小時(shí)后離心取下層沉淀。檢測(cè)沉淀的RNA水平后定量。vimentin正向序列:5′-GCTGCAGGCCCAGATTCA-3′,反向序列:5′-TTCATACTGCTGGCGCACAT-3′;GAPDH正向序列:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,反向序列:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。95 ℃ 65 s,58 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 口腔癌癌組織和癌旁正常組織中miR-409-5p的相對(duì)表達(dá)量

口腔癌癌組織中miR-409-5p相對(duì)表達(dá)量(1.35±0.05)較癌旁正常組織(1.01±0.04)明顯增加(P<0.05)。

2.2 SCC-9細(xì)胞株的確定

SCC-9細(xì)胞中miR-409-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量(1.39±0.02)明顯高于GNM細(xì)胞(1.00±0.04)、SCC-25細(xì)胞(0.52±0.02)、HN6細(xì)胞(0.90±0.02),差異均有顯著性(P<0.05)。故選取口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中miR-409-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量最高的SCC-9細(xì)胞為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

2.3 下調(diào)miR-409-5p對(duì)人口腔癌細(xì)胞SCC-9侵襲和遷移能力的影響

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,miR-409-5p組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均下降(P<0.05;表1、圖1)。

圖1 下調(diào)miR-409-5p對(duì)人口腔癌細(xì)胞SCC-9侵襲和遷移能力的影響(結(jié)晶紫染色,200×)

表1 3組SCC-9細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力比較 %

2.4 miR-409-5p對(duì)人口腔癌細(xì)胞SCC-9 vimentin mRNA及蛋白的影響

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,miR-409-5p組vimentin mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05;圖2、表2)。

圖2 Western blotting法檢測(cè)3組細(xì)胞vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量

表2 3組SCC-9細(xì)胞vimentin mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

miRNA是一種進(jìn)化保守的非編碼、堿基對(duì)較少的單鏈RNA,抑制基因轉(zhuǎn)錄或者使下游基因失活來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生成。研究表明,miRNA可靶向腫瘤基因組上脆性位點(diǎn),使基因發(fā)生缺失、擴(kuò)增或轉(zhuǎn)位,進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄以及翻譯、控制癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展[7-8]。miR-146a可調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[9];miR-365-3p可通過(guò)抑制CDK-10的表達(dá)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和周期產(chǎn)生影響[10]。

miR-409-5p在不同癌癥中其作用不同。王睿等[11]發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-409-5p可下調(diào)肝癌細(xì)胞系HepG2增殖及遷移能力。miR-409-5p在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào),下調(diào)后可通過(guò)調(diào)節(jié)Ras抑制蛋白1來(lái)抑制細(xì)胞增殖及遷移能力[12]。本文結(jié)果顯示,miR-409-5p在口腔癌組織及口腔癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),可抑制口腔癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。

細(xì)胞從上皮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)狀態(tài)被稱(chēng)為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在改變細(xì)胞間質(zhì)表型過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,其主要作用為改變腫瘤細(xì)胞極性、切斷腫瘤細(xì)胞與基底膜之間的粘連,同時(shí)使腫瘤細(xì)胞具備抵抗凋亡、降解細(xì)胞外基質(zhì)的特性,從而使腫瘤細(xì)胞獲得較強(qiáng)的侵襲和遷移能力[14]。而vimentin蛋白為中間絲蛋白,作為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白,對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其上調(diào)可加速癌癥的發(fā)展,在腫瘤細(xì)胞侵襲遷移和維持細(xì)胞正常形態(tài)方面具有重要作用,包括加速其轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)等[15-16]。本研究結(jié)果顯示,下調(diào)SCC-9中miR-409-5p后vimentin表達(dá)下降,進(jìn)而抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述,下調(diào)miR-409-5p能夠抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,其機(jī)制可能與下調(diào)vimentin進(jìn)而抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān),從而為口腔癌的診斷和治療提供新的思路。