李諾，伍亮，張志強

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036）

溫度是影響兩棲動物變態(tài)發(fā)育時長的主要環(huán)境因素之一，高溫可促進(jìn)蝌蚪生長發(fā)育，縮短變態(tài)時長，低溫則延遲發(fā)育進(jìn)程，延長變態(tài)時長[1-5]。黑斑側(cè)褶蛙（Pelophylax nigromaculatus）是有重要經(jīng)濟(jì)價值的兩棲動物，也是稻蛙綜合種養(yǎng)的主要蛙種之一[6]。變態(tài)前后，蝌蚪的規(guī)格、對植物血凝素（PHA-P）的反應(yīng)，受高溫[3-5]、微塑料污染[7]和發(fā)育階段[8]等多種因素影響。目前，關(guān)于低溫條件下延遲蝌蚪發(fā)育的生理效應(yīng)方面的研究報道較少[3]。

植物血凝素抗原（PHA-P 抗原）是一種有絲分裂原，能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，通過評估被注射PHA-P 抗原部位皮膚組織的增厚程度，可整合反映兩棲動物等不同類群脊椎動物的免疫功能[9-11]?，F(xiàn)于2021 年6 月上旬，在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生理生態(tài)實驗室，模擬黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪可能經(jīng)歷的極端低溫環(huán)境，將發(fā)育至37 期的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪，于8 ℃條件下分別處理5 和10 d 后，再轉(zhuǎn)移至25 ℃條件下，繼續(xù)飼養(yǎng)至變態(tài)完成期（46 期）幼蛙，以始終在25 ℃條件下飼養(yǎng)的蝌蚪為對照組，比較46 期幼蛙的存活率、變態(tài)時長、身體大小、PHA-P 的反應(yīng)模式和最大反應(yīng)值的出現(xiàn)時間，從免疫功能整合性變化的角度揭示低溫延遲發(fā)育的機理，為提高黑斑側(cè)褶蛙變態(tài)存活率、實現(xiàn)健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從合肥大圩鎮(zhèn)捕獲的黑斑側(cè)褶蛙卵帶，于60 L的塑料桶中飼養(yǎng)，加入曝氣24 h 以上的自來水，2 d更換一次。用加熱棒控制水溫在（25±1）℃。每日用煮熟的青菜葉飼喂，直至發(fā)育至37 期蝌蚪。蝌蚪分期鑒定采用Gosner 提供的方法[12]。

1.2 飼料、試劑和設(shè)備

主要有蝌蚪飼料、PHA-P 抗原（Sigma L-8754,Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品）、塑料箱、加熱棒、冰箱、電子數(shù)顯卡尺、微量進(jìn)樣器和電子天平等。

1.3 試驗設(shè)計

從60 L 塑料桶中隨機選取發(fā)育至37 期的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪210 只，用電子天平稱量其體質(zhì)量，數(shù)顯卡尺測其體長、尾長，取規(guī)格相似的35 只蝌蚪，于塑料箱（34 cm×24 cm×18 cm）中，每箱35 只，共6 箱，蝌蚪的密度為3.2 只/L。其中，3 箱始終在水溫（25±1）℃、水深13.5 cm 的環(huán)境下飼養(yǎng)，為A 組；剩余3 箱移入溫度為（8±1）℃的冰箱內(nèi)飼養(yǎng)，至第5 d 時，3 箱中分別取出一半蝌蚪，將其置于水溫為（25±1）℃的條件下繼續(xù)飼養(yǎng)，為B 組；剩余的蝌蚪繼續(xù)在溫度為（8±1）℃的冰箱內(nèi)再飼養(yǎng)5 d，至第10 d時，再將3 箱中存活的蝌蚪置于水溫為（25±1）℃的條件下繼續(xù)飼養(yǎng)，為C 組。飼養(yǎng)期間，每2 d 根據(jù)3.2 只/L 的固定密度更換一次水體，每天定時喂食蝌蚪飼料，以塑料板和紗布制作成浮床，營造登陸環(huán)境，飼養(yǎng)至變態(tài)完成期46 期幼蛙為止。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 變態(tài)存活率和變態(tài)時長

統(tǒng)計A、B 和C 組每箱中從37 期蝌蚪發(fā)育至變態(tài)完成期46 期幼蛙的個體數(shù)，計算變態(tài)存活率和變態(tài)時長。

變態(tài)存活率（%）=發(fā)育至46 期幼蛙的個體數(shù)量×100%/初始時的蝌蚪數(shù)量；

變態(tài)時長（d）=發(fā)育至變態(tài)完成期46 期幼蛙的天數(shù)－37 期蝌蚪的處理天數(shù)。

1.4.2 體質(zhì)量與體長

A、B 和C 組個體發(fā)育至46 期幼蛙時，每組每箱中分別取4、3 和2 只個體，用電子天平稱量其體質(zhì)量，數(shù)顯卡尺測其體長。

1.4.3 對PHA-P 的反應(yīng)

測A、B 和C 組每一只個體對PHA-P 的反應(yīng)，以其平均值代表該箱的狀態(tài)，以3 箱的平均值代表該組的狀態(tài)。采用微量進(jìn)樣器，注射劑量為20 μL、質(zhì)量濃度為2.5 g/L 的PHA-P 抗原溶液于46 期幼蛙大腿根部，以數(shù)顯卡尺測量未注射時（0 h）大腿根部的厚度為基準(zhǔn)值，此后在注射后每間隔1 h 測定被注射部位的厚度，每個間隔時間點連續(xù)測定3 次，取平均值，直至9 h。

對PHA-P 的反應(yīng)（%）=（Xh 被注射部位的厚度－0 h 時該部位的厚度）×100%/0 h 時該部位的厚度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。用單因素方差分析比較不同延遲發(fā)育天數(shù)組黑斑側(cè)褶蛙變態(tài)完成期幼蛙變態(tài)時長、體質(zhì)量和體長，以及PHA-P 最大反應(yīng)值的差異。同一處理組內(nèi)，以注射前（0 h）和注射后9 h 內(nèi)逐小時的測量時間點為組內(nèi)因子，用重復(fù)測量方差分析比較不同測量時間點間PHA-P 反應(yīng)的差異。結(jié)果均以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）（Mean±SE）表示，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 變態(tài)存活率、變態(tài)時長和身體大小

經(jīng)統(tǒng)計得出，A、B 和C 組原分別有105、41 和43 只蝌蚪，至變態(tài)完成期46 期幼蛙時，A、B 和C組存活的總幼蛙數(shù)分別為92、18 和12 只?？傻肁、B和C 組的蝌蚪變態(tài)存活率分別為87.62%、43.90%和27.91%，呈下降趨勢。低溫對黑斑側(cè)褶蛙變態(tài)時長、體質(zhì)量和體長的影響見表1。由表1 可見，A—C組變態(tài)時長呈顯著上升趨勢（P<0.05），但體質(zhì)量（P>0.05）、體長（P>0.05）均無明顯的組間差異。

表1 低溫對黑斑側(cè)褶蛙變態(tài)時長、體質(zhì)量和體長的影響①

①同列數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不同表示組間差異顯著性（P<0.05）；字母相同表示組間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 PHA-P 反應(yīng)

低溫對黑斑側(cè)褶蛙46 期幼蛙植物血凝素反應(yīng)模式的影響見表2。由表2 可見，A 組注射后3 h，對PHA-P 的反應(yīng)值最高，2 與3 h 時接近，均顯著高于0 h 及6~9 h（P<0.05）；B 組注射后3 h 最高，與2 h時接近，均顯著高于0 和1 h 及6~9 h（P<0.05）；C 組注射后4 h 最高，與3 h 時接近，均顯著高于0 及7~9 h（P<0.05）。A、B 和C 組的PHA-P 最大反應(yīng)值分別出現(xiàn)在注射后3，3 和4 h，但無明顯的組間差異（P>0.05）。

表2 低溫對黑斑側(cè)褶蛙46 期幼蛙植物血凝素反應(yīng)模式的影響①%

3 討論

在安徽合肥地區(qū)，黑斑側(cè)褶蛙通常在3 月底—4 月初孵化，經(jīng)過2~3 個月，完成變態(tài)發(fā)育成幼蛙。蝌蚪常見于靜水池塘、稻田等處，4—5 月份是蝌蚪發(fā)育的關(guān)鍵時間節(jié)點，也是水溫劇烈波動的時間段，不但會經(jīng)歷熱浪侵襲，而且可能面臨低溫脅迫[8]。隨著低溫處理天數(shù)增加，黑斑側(cè)褶蛙變態(tài)完成期幼蛙的體質(zhì)量、體長變化不明顯，但存活率從延遲0 d 的87.62%下降至延遲5 d 的43.90%、延遲10 d 的27.91%，變態(tài)時間顯著延長，從29.8 d 升至49.9 和58.3 d。說明低溫脅迫天數(shù)的增加，顯著影響了幼蛙的存活能力及發(fā)育至變態(tài)完成期幼蛙的個體數(shù)量，發(fā)育時間顯著延長。幼蛙A、B 和C 組的體質(zhì)量先降后升，體長呈下降趨勢，但均無顯著改變，說明被延長的發(fā)育期不利于其未來存活。

同時，隨著低溫脅迫天數(shù)的增加，存活下來的個體對PHA-P 的最大反應(yīng)值無明顯的組間差異，但C 組對PHA-P 的最大反應(yīng)值出現(xiàn)在注射后4 h，而A 組和B 組均出現(xiàn)在注射后3 h，說明較長時間的低溫脅迫，使變態(tài)完成期幼蛙對外界環(huán)境刺激的反應(yīng)時間延長。幼蛙面對多變的陸地環(huán)境，被捕食的風(fēng)險加大，不利于其未來存活。此前，關(guān)于黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪或幼蛙對PHA-P 反應(yīng)模式和最大反應(yīng)值的測定，常選用注射前（0 h）和注射后3，6，9 和12 h 測量時間點，發(fā)現(xiàn)37~43 期、44~46 期蝌蚪分別在注射后3 和6 h 達(dá)到最大反應(yīng)值[8]，而在21~27 ℃飼養(yǎng)條件下，27 ℃飼養(yǎng)縮短了其變態(tài)時長，但PHA-P 最大反應(yīng)值無組間差異[5]。然而，與低溫處理延遲孵化12 d 的田野林蛙（Rana arvalis）蝌蚪相比，常溫組蝌蚪對PHA-P 的反應(yīng)的最高值高于延遲孵化組[3]，但該研究也只測定了預(yù)設(shè)的PHA-P達(dá)到高峰值時的時間點，即注射后2 d。

蝌蚪對PHA-P 抗原刺激的反應(yīng)強度和峰值延遲或提前，被認(rèn)為與免疫能力有關(guān)[11]。因此，能否精準(zhǔn)界定PHA-P 最大反應(yīng)值發(fā)生的時間點，是確定PHA-P 最大反應(yīng)值出現(xiàn)時間的前提[13]。理論上，測量時間點間隔越小，準(zhǔn)確度越高，但也意味著測量工作量和手握應(yīng)激的次數(shù)也會增加[7]。本研究表明，每間隔1 h 測量1 次，所得的結(jié)果更為準(zhǔn)確，也不會對幼蛙造成額外傷害，值得加以推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

低溫誘導(dǎo)的延遲發(fā)育，顯著降低了變態(tài)完成期幼蛙的存活率，延長了變態(tài)時長，對PHA-P 的反應(yīng)有所后延，不利于幼蛙的未來存活。