趙玉強 卓可兒 郭云 朱燦燦 王行軍 陸小美 田艷麗 胡白石

摘要

瘡痂病是薄殼山核桃上最具毀滅性的病害，帶菌植物材料是傳播瘡痂病的重要來源。準確、靈敏、快速的檢測方法可為該病害流行規(guī)律調(diào)查和防控提供有力的依據(jù)。本文通過比較薄殼山核桃瘡痂病菌Venturia?effusa及其近似種之間的ITS序列差異，設計了特異性引物和TaqMan探針，建立了薄殼山核桃瘡痂病菌的熒光定量PCR檢測方法。特異性檢測結果表明，該方法可以檢測不同地區(qū)的薄殼山核桃瘡痂病菌菌株，而對其近似種以及薄殼山核桃上的其他真菌均沒有信號。本研究建立的檢測方法對薄殼山核桃瘡痂病菌DNA的最低檢測限可達0.5?pg/μL。該方法用于田間樣品檢測時，檢測時間僅需1?h，遠快于常規(guī)的分離培養(yǎng)法。本研究建立的基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測方法為薄殼山核桃瘡痂病菌的快速檢測和監(jiān)測提供了有力工具。

關鍵詞

薄殼山核桃瘡痂病菌;?熒光定量PCR;?TaqMan探針;?快速檢測

中圖分類號：

S?436.64

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022163

Development?and?application?of?TaqMan?fluorescence?quantitative?PCR?for?detection?of?Venturia?effusa

ZHAO?Yuqiang1*，?ZHUO?Keer2，?GUO?Yun2，?ZHU?Cancan1，?WANG?Xingjun3，?LU?Xiaomei4，TIAN?Yanli2，?HU?Baishi2

（1.?Institute?of?Botany，?Jiangsu?Province?and?Chinese?Academy?of?Sciences?（Nanjing?Botanical?Garden?Mem.

Sun?YatSen），?Nanjing?210014，?China;?2.?College?of?Plant?Protection，Nanjing?Agricultural?University，?Key

Laboratory?of?Integrated?Management?of?Crop?Diseases?and?Pests，?Ministry?of?Education，?Nanjing?210095，

China;?3.?Anhui?Fengyang?Plant?Protection?Station，?Chuzhou?233100，?China;?4.?Changzhou?Guomei

Agricultural?Technology?Co.，?Ltd.，?Changzhou?213245，?China）

Abstract

Venturia?effusa?causes?pecan?scab，?which?is?the?most?destructive?disease?in?pecan?orchards.?The?funguscarrying?plant?materials?are?the?important?sources?for?transmission?of?the?scab?disease.?Accurate，?sensitive?and?rapid?detection?of?the?pathogenic?fungi?provides?powerful?measures?for?investigation?of?epidemical?regularity?and?control?of?this?disease.?In?this?study，?a?pair?of?primers?and?a?TaqMan?probe?based?on?the?internal?transcribed?spacers?（ITSs）?of?V.effusa?and?its?related?species?were?designed?and?synthesized?for?fluorescence?quantitative?PCR?assay.?The?results?showed?that?the?fluorescence?quantitative?PCR?assay?facilitated?detection?of?all?V.effusa?strains?regardless?of?their?geographical?origins，?while?no?signals?were?detected?for?the?other?fungi?tested，?including?the?closely?related?Venturia?species?and?other?fungi?isolated?from?pecans.?The?detection?limit?of?this?assay?was?0.5?pg/μL?of?total?DNA.?Compared?to?conventional?culture?method，?the?fluorescence?quantitative?PCR?assay?was?rapid?and?reliable?for?detection?of?V.effusa?in?the?field;?the?whole?detection?process?can?be?finished?in?one?hour，?which?provides?a?valuable?tool?for?rapid?detection?and?identification?of?V.effusa.

Key?words

Venturia?effusa;?fluorescence?quantitative?PCR;?TaqMan?probe;?rapid?detection

薄殼山核桃Carya?illinoinensis?（Wangenh.）?K.?Koch又稱美國山核桃，是綠化的優(yōu)選樹種，其果實又稱碧根果，是世界著名的干果之一。薄殼山核桃原產(chǎn)于美國和墨西哥北部，因其較高的經(jīng)濟價值目前已被引種到全球20多個國家和地區(qū)［12］。大量研究表明，瘡痂?。╯cab）是薄殼山核桃上最具毀滅性的病害［35］。該病害起源于美國，目前已廣泛分布于全球各大薄殼山核桃種植區(qū)，包括美國、墨西哥、南美洲、南非以及中國［3，6］。我國引進薄殼山核桃已有100多年的歷史，在國內(nèi)先后建立了多處萬畝薄殼山核桃基地，發(fā)展勢頭強勁［68］。然而，隨著種植面積的不斷擴大，病蟲害發(fā)生日益嚴重，尤其是瘡痂病的發(fā)生嚴重影響了果實的產(chǎn)量和質(zhì)量。

薄殼山核桃瘡痂病的病原為散生黑星菌Venturia?effusa，可侵染薄殼山核桃的葉片、果實和嫩枝，導致植物的光合作用面積減少，進而影響果實的大小和質(zhì)量［35］。目前，薄殼山核桃瘡痂病菌的檢測主要以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法為主［9］。然而，薄殼山核桃瘡痂病菌在人工培養(yǎng)條件下生長緩慢，容易受到其他腐生菌的干擾而使分離培養(yǎng)具有一定難度，同時檢測效率很低。尚未見關于薄殼山核桃瘡痂病菌分子生物學檢測的報道。

本研究基于TaqMan探針的熒光定量PCR方法建立了薄殼山核桃瘡痂病菌的快速檢測方法，構建了標準曲線，并對方法的特異性和靈敏度進行了驗證，同時評價了該方法對實際樣品的檢測效果。

1?材料與方法

1.1?供試菌株

供試菌株包括分離自江蘇句容、高淳、金壇、泗洪和東海地區(qū)薄殼山核桃種植園的瘡痂病菌15株，以及薄殼山核桃瘡痂病菌的形態(tài)近似種和薄殼山核桃上分離的其他真菌共計21株。本研究的參試菌株分別來源于江蘇省中國科學院植物研究所和南京農(nóng)業(yè)大學植物檢疫實驗室（表1）。

1.2?儀器和試劑

熒光定量PCR儀為ABI公司生產(chǎn)的7500型。真菌DNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)。Premix?Ex?TaqTM（Probe?qPCR）、pMD19T載體連接試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自大連寶生物公司。

1.3?核酸提取

按照真菌?DNA?提取試劑盒說明書提取待測菌株的基因組DNA。

1.4?引物及探針的設計與合成

分離自江蘇金壇的薄殼山核桃瘡痂病菌JT11菌株的ITS序列，為本研究測序后上傳至GenBank?（登錄號：ON055759），該序列與NCBI中薄殼山核桃瘡痂病菌多個菌株的一致性均超過99%。利用BioEdit軟件進行序列比對，尋找差異位點設計薄殼山核桃瘡痂病菌的特異性引物對VEF/VER（5′TAGTCTGAGAACCAGTCG3′/5′CGGGGACGGGGCTCAACG3′）和探針VEP（5′FAMCACACCTGTTCGAGCGCCATTTCABHQ13′），預期產(chǎn)物大小為224?bp（圖1）。探針和引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5?熒光定量PCR反應體系的優(yōu)化與建立

以分離自江蘇金壇的薄殼山核桃瘡痂病菌JT11菌株的DNA（50?pg/μL）作為熒光定量PCR擴增模板。20?μL反應體系為：?Premix?Ex?Taq（TaKaRa）10?μL，ROX?Reference?Dye?Ⅱ?0.4?μL，上、下游引物各0.4?μL，TaqMan探針0.4?μL，模板1?μL，ddH2O?7.4?μL。反應條件為：?95℃?30?s;95℃?15?s，60℃?35?s，40個循環(huán)。試驗重復3次。

熒光定量PCR反應體系的優(yōu)化主要是對反應體系中的引物和探針濃度進行優(yōu)化。上、下游引物濃度設置為0.1～1?μmol/L，并以0.1?μmol/L依次遞增;探針濃度設置為0.2～1?μmol/L，以0.2?μmol/L依次遞增，其他條件不變。反應結束后根據(jù)Ct值和ΔRn值確定最佳引物和探針濃度。

1.6?標準曲線的建立

1.6.1?標準質(zhì)粒的構建

以提取的JT11菌株基因組DNA為模板，利用引物VEF/VER進行PCR擴增?；厥漳康钠魏笈cpMD19T載體連接、轉化DH5α感受態(tài)細胞。挑選陽性克隆子37℃過夜搖菌后，提取質(zhì)粒，并委托南京擎科生物公司進行測序驗證。經(jīng)鑒定正確后，利用分光光度計測定質(zhì)粒濃度，并按照下列公式計算質(zhì)?？截悢?shù)：

標準質(zhì)粒的拷貝數(shù)=（質(zhì)量數(shù)×6.023×1023）/（質(zhì)粒堿基對數(shù)×660）。

1.6.2?標準曲線的制作

將標準質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，得到3×107～3×101?拷貝/μL?系列模板，利用優(yōu)化后的檢測體系進行熒光定量PCR，將得到的Ct值為縱坐標，起始模板濃度的對數(shù)為橫坐標，制作標準曲線。

1.7?特異性檢測

采用真菌?DNA?提取試劑盒提取表1中菌株基因組DNA，濃度調(diào)整為50?pg/μL作為檢測模板。以菌株JT11的基因組DNA為陽性對照，無菌超純水為陰性對照，利用優(yōu)化的最佳反應體系和條件進行特異性檢測。

1.8?靈敏度檢測

以JT11菌株的基因組DNA為模板，利用無菌水對模板進行梯度稀釋，得到5×102～5×10-2?pg/μL系列濃度，進行熒光定量PCR檢測。

1.9?實際樣品檢測

采自南京高淳、安徽鳳陽、浙江臨安地區(qū)的病葉和病果樣品共計18份。植物樣品按照Wang?等的NaOH法［10］提取DNA。主要方法為：取發(fā)病的植物組織，每毫克組織中加入10?μL?NaOH（0.5?mol/L），?在1.5?mL離心管中充分研磨后，12?000?r/min離心5?min，取5?μL上清液，加入495?μL?Tris緩沖液（100?mmol/L，pH?8.0），充分混合后取1?μL用于熒光定量PCR檢測。同時，對樣品進行病原菌分離，并對其進行ITS序列分析，與本研究建立的熒光定量PCR方法的檢測結果進行比對。

2?結果與分析

2.1?熒光定量PCR反應體系的優(yōu)化與建立

通過比較不同濃度的引物和探針反應后的Ct值和ΔRn值，并在擴增效率差異不明顯的情況下，從經(jīng)濟節(jié)約的角度考慮，引物濃度為0.5?μmol/L、探針的濃度為0.6?μmol/L時為最佳反應濃度。本研究最終建立的反應體系（20?μL）為：?Premix?Ex?Taq?10?μL，ROX?Reference?DyeⅡ?0.4?μL，上、下游引物VEF/VER（終濃度為0.5?μmol/L）各?0.4?μL，TaqMan探針VEP（終濃度為0.6?μmol/L）0.4?μL，模板1?μL，ddH2O?7.4?μL。

2.2?標準曲線的建立

以10倍倍比稀釋的3×107～3×101?拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板，以空質(zhì)粒為陰性對照，進行熒光定量PCR擴增。結果如圖2所示，模板濃度與可檢測到的熒光信號的循環(huán)數(shù)呈負相關，相關系數(shù)R2=0.997?7，大于0.98，?表明Ct值與倍比稀釋的標準質(zhì)粒濃度之間具有良好的線性關系。

2.3?特異性檢測結果

利用2.1中優(yōu)化建立的檢測體系，對15株薄殼山核桃瘡痂病菌以及21株參試菌株進行熒光定量PCR檢測。檢測結果如圖3所示，不同來源的15株薄殼山核桃瘡痂病菌均有明顯的擴增曲線，Ct值為24.21～25.66，而其他參試菌株以及陰性對照均無擴增（本試驗中Ct值>35視為陰性）。結果表明，本研究設計的引物和探針具有較好的種內(nèi)適用性和種間特異性。

2.4?靈敏度檢測

將JT11菌株的DNA模板濃度稀釋為500、50、5、0.5?pg/μL和0.05?pg/μL，分別進行熒光定量PCR檢測。靈敏度試驗結果表明，本研究所建立的熒光定量PCR檢測的最低DNA濃度為0.5?pg/μL（圖4），即20個分生孢子的基因組DNA。

2.5?實際樣品檢測結果

利用分離培養(yǎng)和熒光定量PCR法對采自南京高淳、安徽鳳陽、浙江臨安地區(qū)的18份病葉和病果樣品進行了檢測。結果顯示，熒光定量PCR檢測中有10份樣品呈陽性，結果與分離培養(yǎng)法一致。但是，薄殼山核桃瘡痂病菌人工培養(yǎng)生長緩慢，分離培養(yǎng)法所需試驗周期長，分離和鑒定過程需要1個月左右，且容易受到腐生菌的干擾，需要多次分離。綜上所述，熒光定量PCR法檢測薄殼山核桃瘡痂病菌特異性強且省時省力，適用于實際樣品的快速檢測。

3?結論與討論

薄殼山核桃瘡痂病是世界各薄殼山核桃產(chǎn)區(qū)的重要病害［3，6］，在其傳播過程中，薄殼山核桃瘡痂病菌隨帶病苗木和接穗的調(diào)運進行遠距離傳播，進而造成病區(qū)的擴大和形成新病區(qū)［11］。因此，為避免薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)因瘡痂病帶來的損失，亟須準確、快速的檢測技術，限制帶菌苗木的傳播，保障薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本研究以ITS序列為靶標，建立了薄殼山核桃瘡痂病菌的熒光定量PCR檢測方法。結果表明，結合DNA快速提取法，本研究建立的檢測體系對實際樣品檢測僅需1?h，實現(xiàn)了病害的快速檢測。

瘡痂病是薄殼山核桃上最具毀滅性的病害［45］。目前，關于瘡痂病病原的鑒定，主要采用分離培養(yǎng)法。然而，由于薄殼山核桃瘡痂病菌人工培養(yǎng)生長緩慢，給分離培養(yǎng)帶來一定難度，同時效率很低。本文建立的基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測方法，能夠特異性識別薄殼山核桃瘡痂病菌，檢測的最低限DNA為0.5?pg/μL，且檢測時間僅需1?h，在檢測效率上遠高于常規(guī)的分離培養(yǎng)法。

薄殼山核桃瘡痂病菌屬于黑星菌屬真菌，與枝孢屬?Cladosporium?sp.的分生孢子在形態(tài)上相似，早期被鑒定為枝孢菌［1213］。直至2005年，Beck等［14］根據(jù)ITS序列，才將薄殼山核桃瘡痂病菌重新劃分為V.effusa。前期研究發(fā)現(xiàn)，在蚜蟲發(fā)生嚴重的種植園，枝孢霉能夠引起薄殼山核桃的煤污?。?5］。因此，我們在設計薄殼山核桃瘡痂病菌特異性引物時，將分離自薄殼山核桃的枝孢霉作為近似種進行序列比對，并進行特異性檢測。此外，我們在評價薄殼山核桃瘡痂病菌熒光定量PCR檢測體系的特異性時，還使用了薄殼山核桃褐斑病菌Colletotrichum?sp.、黑斑病菌Pestalotiopsis?microspora以及枝枯病菌?Diaporthe?sp.作為測試菌株。結果發(fā)現(xiàn)，本研究建立的薄殼山核桃瘡痂病菌的熒光定量PCR檢測方法對來自薄殼山核桃的不同病原菌有區(qū)分能力，說明該方法的檢測結果準確可靠。

綜上所述，TaqMan熒光定量PCR技術具有特異性好、靈敏度高和耗時短等

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（責任編輯：田?喆）