蔡朦朦，楊習曼，張芳，秦琴*

（1.山西醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學 第五臨床醫(yī)學院，山西 太原 030001）

0 引言

Enrico Sertoli 在1865 年提出“支持細胞”（Sertoli cell，SC）的概念［1］。目前已獲得多種永生化的支持細胞系，但這類細胞有著表型改變，對激素的反應不敏感，免疫特性分化等缺點；相比之下，原代支持細胞保留原物種的特性，是基礎醫(yī)學等領域研究的金標準［2］。Cameron 等［3］在20 世紀90 年代創(chuàng)立了大鼠睪丸原代支持細胞的分離培養(yǎng)方法，但有著操作繁瑣，培養(yǎng)溫度過高，支持細胞純度低等明顯缺陷。在此基礎上，國內(nèi)學者多采用兩步酶消化法，37 ℃培養(yǎng)獲取大鼠睪丸原代支持細胞［4-5］，Bernardino 等［6］采用精細的機械分離和一系列酶消化提取支持細胞，該領域國內(nèi)外學者普遍采用機械法和酶消化法分離大鼠睪丸支持細胞，但是都存在酶消化時間過度、間質細胞和成纖維細胞無法除盡以及細胞產(chǎn)量低等不足之處。

支持細胞在精子發(fā)生過程為生殖細胞提供營養(yǎng)支持、免疫保護、吞噬清除、血睪屏障功能等，被稱為生精細胞的“保姆細胞”［7］。精索靜脈曲張（varicocele，VC）、睪丸扭轉、無精子癥、高海拔缺氧等都會引起男性睪丸內(nèi)供氧不足，損害睪丸細胞的功能、精子的數(shù)量和活力［8］。有報道在低氧誘導的動物模型中，睪丸內(nèi)發(fā)生極度缺氧，支持細胞呈現(xiàn)脂滴改變和高度空泡化，與生殖細胞間隙連接被破壞，出現(xiàn)精子數(shù)量減少的現(xiàn)象［9-10］。Galardo 等［11］為探索缺氧誘導因子（HIF）是否參與大鼠支持細胞乳酸產(chǎn)生和促卵泡刺激素（FSH）滋養(yǎng)細胞功能，Hao 等［12］為研究缺氧對支持細胞增殖和 occludin 蛋白的表達，分別用氯化鈷、梯度氧濃度體外刺激大鼠支持細胞建立了低氧支持細胞模型。本研究擬通過改良過往分離純化原代支持細胞的方法，優(yōu)化培養(yǎng)細節(jié)，以獲取高純度的原代支持細胞制備低氧支持細胞模型，模擬各種臨床男性不育癥導致的睪丸內(nèi)的低氧狀態(tài)，闡述男性生精障礙的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

18 d-22 d 的健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，由山西省人民醫(yī)院動物中心提供。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基購自Hyclone 公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司；胰酶、DNA 酶、I 型膠原酶、油紅O、伊紅染液購自北京索萊寶公司；鼠抗-Vimentin 抗體購自Santa Cruz 公司；CY3 羊抗小鼠IgG 二抗購自武漢博士德公司，兔抗-HIF-1α 抗體購自北京博奧森公司，兔抗-PCNA 抗體購自美國Proteintech 公司，羊抗兔IgG 二抗購自武漢愛博泰克公司。

1.1.3 主要儀器設備

CO2培養(yǎng)箱、三氣培養(yǎng)箱購自德國美墨爾特公司；普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡購置日本尼康公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）電泳儀/電轉儀/半干轉儀/凝膠成像分析儀器購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 原代支持細胞的分離與純化

對解剖室進行紫外殺菌后，將SD 雄鼠頸椎脫臼處死，大鼠在體積分數(shù)75%酒精中浸泡10 min后取出，無菌器械取出睪丸，置于4 ℃ 預冷磷酸鹽緩沖液（prechilled phosphate-buffered saline，PBS）中清洗兩遍去除睪丸表面黏液，剪刀剝離睪丸白膜，用鑷子機械去除細胞外基質；暴露睪丸實質后，去除其中夾雜的血管雜質，PBS 清洗兩次后，用眼科剪將睪丸實質剪碎成約1 mm3的碎塊，加入配置的甘氨酸溶液振蕩混勻，靜置10 min，待組織沉降后移除上清液，加入剩余組織液4 倍體積的體積分數(shù)0.25%胰酶（pH 7.4）溶液，37 ℃水浴消化15 min，加入含有體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基（含有2.5 mmol/LL-谷氨酰胺，15 mmol/L HEPES，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/ml）終止消化，反復輕輕吹打后，吸取上清液保存，隨后將剩余沉淀加入質量分數(shù)0.022 5%Ⅰ型膠原酶和質量分數(shù)0.005% DNA 酶的混合液（pH 7.4）在37 ℃水浴消化10 min，終止消化后，反復吹打成團的細胞，用400 目過濾篩過濾兩次酶消化后的細胞，將收獲的細胞用37 ℃預熱PBS 和培養(yǎng)基先后分別洗滌3 次，每次1000 r/min，離心5 min，結束后細胞重懸于完全培養(yǎng)基，以2×106/孔均勻鋪在6 孔板中，置于35 ℃，體積分數(shù)5%CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至2 d 后，用20 mmol/L Tris-HCL（pH 7.4）溶液低滲處理去除精原細胞，待支持細胞完全貼壁且生長狀態(tài)達到最佳，對其進行相應處理用于后續(xù)實驗。

1.2.2 原代支持細胞的鑒定

1.2.2.1 免疫熒光檢測Vimentin 蛋白

24 孔細胞培養(yǎng)板中放置用多聚賴氨酸包被的玻片，將提取的原代支持細胞以4×105/孔接種在培養(yǎng)板中，制作細胞爬片，經(jīng)過純化培養(yǎng)4 d 后，預冷PBS 洗滌2 遍，常溫下用質量分數(shù)4% 多聚甲醛固定細胞30 min；之后用PBS洗滌3 遍，每次5 min，每個細胞爬片加500 μL體積分數(shù)0.1% TritonX-100，孵育20 min，PBS洗滌3 遍后，繼續(xù)加入體積分數(shù)3%過氧化氫溶液孵育10 min；換用TBST 洗滌3 次后，用質量分數(shù)5% 牛血清白蛋白（5%BSA）封閉細胞1 h，隨后加入含有質量分數(shù)1% BSA 的PBS 稀釋的鼠抗-Vimentin 抗體（1∶100），4 ℃過夜后，細胞用PBS 洗滌三遍，滴加CY3 羊抗小鼠IgG 二抗，室溫下在搖床上孵育1 h，PBS 洗滌3 次后，加入DAPI 染核15 min，PBS 洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)Vimentin 蛋白表達并拍照。

1.2.2.2 HE染色

原代支持細胞培養(yǎng)至4 d，質量分數(shù)4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌3 次，每次2 min，蘇木素染細胞核10 min，蒸餾水洗3 次每次5 min，鹽酸酒精分化數(shù)秒后，自來水洗返藍，加入伊紅染液染色5 min 后，自來水洗后，進行梯度酒精脫水，二甲苯洗滌2 次，每次2 min，最后用中性樹膠封片。

1.2.2.3 油紅O染色

原代支持細胞培養(yǎng)至 4 d，經(jīng)質量分數(shù)4%多聚甲醛固定，4 ℃預冷的 PBS 洗滌后，油紅O 染液在 37 ℃下染色 30 min，用 體積分數(shù)60%異丙醇分色至背景無色，PBS 洗3 次，蘇木素染核10 min，自來水藍化 10 min，蒸餾水洗后用質量分數(shù)10%甘油封片。

1.2.3 制備低氧支持細胞模型

1.2.3.1 實驗分組

隨機將處于生長對數(shù)期的原代SC 分為3 組，常氧組（對照組，N組）、低氧24 h組、低氧48 h組；N組細胞分別在體積分數(shù)21% O2、35 ℃二氧化碳箱繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，低氧24 h 組、低氧48 h 組在1%O2、35 ℃的三氣培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.3.2 免疫熒光檢測支持細胞內(nèi)HIF-1α的表達

3 組SC 經(jīng)固定、抑制內(nèi)源性過氧化物、破膜、封閉處理后，加入含1% BSA 兔抗-HIF-1α抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜后，加入488-羊抗兔IgG 二抗，孵育1 h 后，洗滌，加入DAPI 染核，封片，熒光顯微鏡下觀察每組細胞爬片HIF-1α 的表達情況，不同批次的SC 重復3 次以上實驗。

1.2.3.3 western blot測定HIF-1α、PCNA蛋白

將培養(yǎng)好SC 加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液（100∶1），冰上裂解20 min，12 000 r/min、離心15 min 提取SC 內(nèi)蛋白；進行SDS-PAGE電泳，每孔上樣量為50 μg，60 V～80 V 條件下蛋白條帶泳至電泳槽底部，將凝膠中的目的蛋白和內(nèi)參蛋白轉移至硝酸纖維素膜，質量分數(shù)5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入兔抗-HIF-1α抗體（1∶1000）、兔抗-PCNA 抗體（1∶2000）、HRP 標記的β-actin 抗 體（1∶5000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌后，加入HRP 標記的羊抗兔IgG 多克隆抗體（1∶8000），室溫孵育1 h，TBST 再次洗滌3 次。用凝膠成像分析儀進行條帶顯影和拍照，Image J 軟件分析條帶灰度值。計算HIF-1α、PCNA 的平均光密度比值：HIF-1α、PCNA（目的蛋白）光密度值/β-actin（內(nèi)參蛋白）光密度值。分析3 組蛋白表達差異性，不同批次的SC 重復3 次以上的實驗。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)。各組蛋白表達灰度值以xˉ±S表示，單因素方差分析及LSD 用于組間比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 原代支持細胞的形態(tài)和特征鑒定

2.1.1 大鼠睪丸原代支持細胞的形態(tài)和生長特點

初步提取的支持細胞是體積較小的圓點，呈現(xiàn)較強的折光性，培養(yǎng)2 d 后支持細胞呈梭形，伸出一個或多個突觸，幾乎完全貼壁，經(jīng)Tris-HCl 低滲處理后可除去漂浮的生精細胞，培養(yǎng)至第3-4 d，胞體變大呈橢圓形，胞核明顯，胞質內(nèi)出現(xiàn)圓形發(fā)亮的脂滴，細胞間互相連接呈網(wǎng)狀結構；細胞培養(yǎng)至一周時，整個胞體拉伸變長變大，細胞間連接成單層片狀，此后細胞生長速度變慢；傳代后支持細胞幾乎停止增殖，生長緩慢，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)不佳，支持細胞的體外生長周期為2 周左右（圖1）。

圖1 原代支持細胞培養(yǎng)及形態(tài)學觀察（a）剛提取的原代支持細胞；（b）培養(yǎng)2 d的原代支持細胞；（c）培養(yǎng)3 d的原代支持細胞；（d）培養(yǎng)4 d的原代支持細胞；（e）培養(yǎng)7 d的原代支持細胞；（f）第一代支持細胞（Bar=100 μm）Fig.1 Culture and morphological observation of primary Sertoli cells(a) Freshly extracted primary Sertoli cells; (b) Primary Sertoli cells cultured for 2 days; (c) Primary Sertoli cells cultured for 3 days;(d) Primary Sertoli cells cultured for 4 days; (e) Primary Sertoli cells cultured for 7 days;(f) Sertoli cells of the first generation (Bar=100 μm)

2.1.2 支持細胞內(nèi)Vimentin蛋白的表達

Vimentin 是支持細胞的特異性結構標志［13］，熒光顯微鏡下細胞胞質內(nèi)發(fā)出明亮的紅色熒光，紅色熒光幾乎布滿整個胞質，包裹著圓形或橢圓型的胞核，表示細胞內(nèi)含有Vimentin 蛋白與Vimentin 抗體發(fā)生了特異性結合，即紅色熒光的細胞為SC；非特異性DAPI 染色的胞核發(fā)出藍色熒光，代表了全部細胞總數(shù)；鏡下隨機選取15 個不同視野下的支持細胞，每個視野下隨機計數(shù)200 個細胞，SC 的純度= Vimentin 陽性細胞/細胞總數(shù)×100%，支持細胞純度約為99.43%（圖2）。

圖2 Vimentin免疫熒光鑒定睪丸原代支持細胞（a）細胞質中Vimentin陽性表達；（b）細胞核DAPI染色；（c）a與b疊加圖片（Bar=50 μm）Fig.2 Vimentin immunofluorescence identification of primary Sertoli cells in testis(a) Vimentin positive expression in the cytoplasm; (b) DAPI staining of the nucleus;(c) superimposed pictures of a and b (Bar=50 μm)

2.1.3 HE染色和油紅O染色的支持細胞

HE 染色下的SC 細胞整個胞體呈梭形或不規(guī)則狀，有一個或多個粗大突起，胞質豐富呈淡紅色；油紅O 染色下的SC，胞體不規(guī)則，細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不一的紅色圓形脂滴，胞核呈現(xiàn)圓形或橢圓形淡紫色（圖3）。

圖3 原代支持細胞的HE染色、油紅O染色（a）HE染色，“↑”所指為原代支持細胞（200×）；（b）油紅O染色，“↑”所指為原代支持細胞中的紅色脂滴（Bar=20 μm）Fig.3 HE staining and oil red O staining of primary Sertoli cells(a) "↑" points at primary Sertoli cells (200×); (b) "↑" points at the red lipid droplets in the primary Sertoli cells (Bar=20 μm)

2.2 低氧對支持細胞生長和增殖的影響

2.2.1 體積分數(shù)1%O2培養(yǎng)的支持細胞生長狀態(tài)

低氧培養(yǎng)的SC 胞質內(nèi)顆粒物質增多、胞體回縮、間隙增大、SC 有明顯的空泡、生長狀態(tài)不佳，隨著缺氧時間的延長，SC 死亡明顯增多（圖4）。

圖4 低氧培養(yǎng)24 h、48 h的原代支持細胞（a）低氧培養(yǎng)24 h的原代支持細胞；（b）低氧培養(yǎng)48 h的支持細胞；“↑”所指為支持細胞內(nèi)的空泡（Bar=50 μm）Fig.4 Primary Sertoli cells cultured in hypoxia for 24 h and 48 h(a) Primary Sertoli cells under 24-hour hypoxia;(b) Primary Sertoli cells under 48 h hypoxia; "↑" refers to vacuoles in Sertoli cells (Bar=50 μm)

2.2.2 低氧下原代支持細胞HIF-1α 和PCNA 的表達

免疫熒光結果顯示，常氧時 HIF-1α 在SC胞質中表達。低氧處理24 h 后，部分HIF-1α進入細胞核，48 h 大量HIF-1α 進入細胞核（圖5）。western blot 的結果顯示，與常氧組相比，低氧24 h 組［（1.30±0.17）vs（0.54±0.17），P＜0.05）］和低氧48 h 組［（1.09±0.17）vs（0.54±0.17），P＜0.05）］的HIF-1α 表達水平顯著升高；PCNA 蛋白在低氧24 h 組［（0.47±0.08vs0.75±0.08，P＜0.05）］和低氧48 h 組［（0.23±0.08）vs（0.75±0.08），P＜0.05）］隨著低氧時間的延長而顯著性降低，而低氧24 h組和低氧48 h 組，HIF-1α、PCNA 表達量均無顯著性差異（P＞0.05）（圖6）。

圖6 低氧對支持細胞HIF-1α和PCNA蛋白表達的影響Fig.6 Effects of hypoxia on the expression of HIF-1α and PCNA proteins in primary Sertoli cells

3 討論

國內(nèi)外學者常用胰酶和膠原酶兩步法結合39 ℃或37 ℃的熱應激原理誘導生精細胞凋亡法分離純化大鼠睪丸SC［14-15］，但仍存在實驗時間長、損傷支持細胞等缺點。在以往研究基礎上，我們總結了提高SC 提取效率的關鍵點：（1）動物選擇：出生18-22 d 處于青春前期大鼠，此期大鼠睪丸支持細胞豐富且增殖力較強，生精細胞數(shù)量相比于成熟期少，污染率低，睪丸還未下沉到陰囊部位，支持細胞更容易分離純化［6］。（2）消化過程：生精小管被剪碎后加入甘氨酸溶液隨重力下沉，能夠更好地釋放消除睪丸間質細胞；胰酶消化后保留上清液，目的是防止分離的SC 二次消化過度，提高了SC 產(chǎn)量；二次酶消化過程中，在I 型膠原酶中加入了DNA 酶，相比于大多數(shù)學者使用單一的IV 型膠原酶，二次消化酶混合液濃度較低，對細胞的損傷小，同時加快了第一步酶消化形成的黏液團狀生精小管分解成單個支持細胞的速率，提高了消化效率。（3）培養(yǎng)溫度：人類睪丸內(nèi)精子發(fā)生的最適溫度要低于體溫的2 ℃～8 ℃［16］，如果睪丸溫度長期過高，可能引起睪丸內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，導致少、弱精子癥等男性不育癥［17-18］。培養(yǎng)溫度過高會損傷支持細胞的結構和功能，我們將分離的SC 培養(yǎng)在35 ℃培養(yǎng)箱中，利用支持細胞貼壁迅速特性，定時低滲處理后換液可有效去除生精細胞。（4）特征鑒定：波形纖維蛋白（Vimentin，一種III 型中間纖維），是支持細胞骨架的主要蛋白成分，影響精子發(fā)生［19］。在對支持細胞的鑒定中，通過檢測Vimentin 表達、HE 染色、油紅 O 染色共同對支持細胞進行鑒定及純度測定［20-21］，分離出的支持細胞純度較高。表明我們成功分離培養(yǎng)出高純度的大鼠睪丸SC，為后續(xù)的體外實驗奠定了基礎。

HIF-1α 是目前發(fā)現(xiàn)在缺氧狀態(tài)下可發(fā)揮活性的核轉錄因子，是HIF-1 的活性亞基。缺氧時，HIF-1α 蛋白降解受阻，表達位置從胞漿轉移到細胞核，與HIF-1β 結合成為有活性的HIF-1，激活下游基因［22］。據(jù)報道，睪丸缺氧是VC 導致男性不育的可能機制，HIF-1α 在VC 大鼠模型睪丸內(nèi)高表達，激活下游細胞凋亡相關信號通路如Caspase-3/Bcl-2/Bax 的表達，促進了睪丸細胞的凋亡［23］。SC 在青春期停止增殖，最終數(shù)量決定了生精細胞的生精能力和成熟期睪丸大小，維持睪丸正常生精［7］。文獻表明各種因素誘導下的大鼠睪丸內(nèi)極度缺氧，造成與精子發(fā)生密切的支持細胞數(shù)量減少、功能和結構的損壞，導致生精障礙［24］。PCNA 是細胞增殖的陽性標記物，在哺乳動物DNA 復制與修復，細胞增殖分化周期進程中起重要作用［25］。大量研究表明，細胞增殖與氧氣濃度密切相關，重度缺氧會造成細胞內(nèi)線粒體和內(nèi)質網(wǎng)結構紊亂，抑制細胞增殖［26］，HIF-1α 可以通過擾亂細胞周期過程抑制細胞增殖［27］。本研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導的SC 內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡，細胞結構被破壞，HIF-1α 在嚴重缺氧環(huán)境中大量移位至SC 胞核中，PCNA 蛋白在低氧支持細胞中表達顯著降低。表明嚴重低氧可能通過激活HIF-1α 轉錄活性啟動或促進細胞凋亡、自噬信號以及直接擾亂細胞周期，進而影響大鼠睪丸內(nèi)SC 的增殖能力。

4 結論

本次實驗觀察到原代SC 培養(yǎng)至3-4 d 時，形態(tài)較為典型，適合各種形態(tài)學觀察實驗；培養(yǎng)至3-7 d 階段，增殖能力強，生長速度快，純度較高；而傳代后的SC 生長狀態(tài)欠佳。免疫熒光法鑒定支持細胞內(nèi)Vimentin 蛋白表達、HE染色觀察到支持細胞形態(tài)，油紅O 染色呈現(xiàn)了支持細胞內(nèi)脂滴，共同快速準確地鑒定出支持細胞及其純度，是有效鑒定睪丸支持細胞的手段。在實驗中利用第一代處于生長對數(shù)期的支持細胞，成功建立了體外低氧支持細胞模型，并且觀察到低氧對SC 增殖的抑制，因此低氧誘導原代SC 作為研究低氧致男性不育機制的體外細胞模型可能較為合適。