趙 璐，劉 洋

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)系；2.免疫學(xué)系，北京 100005

病毒感染嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康,尋找更加高效的治療方案、研發(fā)相應(yīng)的抗病毒藥物具有重要的臨床意義,也是亟待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。宿主細(xì)胞代謝與病毒感染息息相關(guān),病毒感染能導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生代謝重塑,而宿主細(xì)胞內(nèi)代謝狀態(tài)的變化也能反過(guò)來(lái)作用于病毒感染。已有研究證明了宿主細(xì)胞內(nèi)的乳酸、琥珀酸、絲氨酸等多種代謝物在病毒感染后含量發(fā)生明顯改變,并通過(guò)多種不同機(jī)制調(diào)節(jié)病毒感染及自身抗病毒天然免疫[1-4],進(jìn)一步鑒定和探究調(diào)控病毒感染的新型宿主代謝物仍具重要意義。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明GABA在免疫系統(tǒng)也發(fā)揮重要作用。例如,B細(xì)胞產(chǎn)生的GABA具有免疫調(diào)節(jié)功能,能抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[5]。GABA在水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)感染的小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(mouse bone marrow-derived macrophages,BMDMs) 和SARS-CoV-2感染的Vero E6 TMPRSS2+細(xì)胞中會(huì)發(fā)生明顯的上調(diào)[6-7],提示宿主細(xì)胞內(nèi)GABA在病毒感染過(guò)程中可能扮演重要角色。因此,本研究旨在探究GABA在VSV感染小鼠巨噬細(xì)胞中的調(diào)控作用,為相關(guān)病毒感染性疾病的治療提供可能的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6～8 周SPF級(jí)C57BL/6小鼠(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.1.2 細(xì)胞及病毒:小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞(America Type Culture Collection,ATCC);VSV由第二軍醫(yī)大學(xué)潘衛(wèi)教授贈(zèng)予,并由本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增保存。

1.1.3 試劑:DMEM培養(yǎng)基(Corning公司);胎牛血清(Gibco公司);CCK-8試劑盒(Solarbio公司);GABA(MCE公司);總RNA提取試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(上海東洋紡生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的獲取和培養(yǎng):給小鼠腹腔注射2 mL高壓滅菌的3%羥乙基淀粉肉湯培養(yǎng)基,3～4 d后,抽取小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以5×105個(gè)細(xì)胞/mL接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在37 ℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。第2天,將細(xì)胞換液,加入10、30、50和70 mmol/L GABA或PBS預(yù)處理細(xì)胞2 h,隨后進(jìn)行VSV感染(MOI=1),8 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性:將RAW264.7細(xì)胞系以104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,在37 ℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。第2天,將細(xì)胞換液,加入10、30、50和70 mmol/L GABA或PBS處理細(xì)胞。10 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度值(A)。

1.2.3 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GFP-VSV水平:將RAW264.7細(xì)胞系經(jīng)70 mmol/L GABA或PBS處理2 h,隨后用表達(dá)GFP熒光標(biāo)簽的重組病毒GFP-VSV感染,8 h后用熒光顯微鏡直接觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GFP-VSV水平:將RAW264.7細(xì)胞系經(jīng)30、50和70 mmol/L GABA或PBS處理2 h,隨后用GFP-VSV感染,8 h后收集細(xì)胞,用PBS洗滌細(xì)胞1次,離心后將細(xì)胞沉淀重懸于0.5 mL PBS中,并轉(zhuǎn)移至流式管,使用LSRFortessa流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例及GFP熒光強(qiáng)度,使用FlowJo軟件分析所得數(shù)據(jù)。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá):收集的RAW264.7細(xì)胞系或小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞,利用總RNA提取試劑盒提取總RNA,用Nanodrop測(cè)量RNA的濃度,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。以Actb為內(nèi)參,采用公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GABA不影響細(xì)胞活性

用10、30、50和70 mmol/L GABA處理RAW264.7細(xì)胞系10 h,與對(duì)照組相比,細(xì)胞活性沒(méi)有明顯變化,即此劑量GABA不會(huì)造成對(duì)細(xì)胞的毒性(圖1)。

The CCK8 assay was used to examine the viability of RAW264.7 cell line after treatment with the indicated dose of GABA for 10 hours.圖1 不同劑量GABA對(duì)RAW264.7細(xì)胞系活性的影響Fig 1 The effect of different dose of GABA on the viability of RAW264.7 cell n=4)

2.2 GABA增強(qiáng)GFP-VSV感染RAW264.7細(xì)胞系中的熒光強(qiáng)度

用GABA預(yù)處理的RAW264.7細(xì)胞系在GFP-VSV感染8 h后, GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例及細(xì)胞內(nèi)GFP熒光強(qiáng)度與對(duì)照組細(xì)胞相比顯著增加,即GABA促進(jìn)了GFP-VSV感染RAW264.7細(xì)胞系(圖2A,B),且呈劑量依賴(lài)性(圖2C)。

The levels of GFP-VSV in RAW264.7 cell line pre-treated with the indicated dose of GABA or PBS for 2 hours and infected with GFP-VSV for 8 hours were observed by fluorescence microscopy (A) and were detected by flow cytometry (B,C) (n=3);Scale bar=100 μm; MFI.mean fluorescence intensity; *P<0.05,**P< 0.01 compared with GABA 0 mmol/L group.圖2 GABA對(duì)GFP-VSV感染RAW264.7細(xì)胞系中熒光強(qiáng)度的影響Fig 2 The effect of GABA on fluorescence intensity in RAW264.7 cell line infected with GFP-VSV

2.3 GABA提高VSV感染的RAW264.7細(xì)胞系中VSV mRNA水平

與對(duì)照組相比,GABA預(yù)處理的RAW264.7細(xì)胞系中VSV RNA水平明顯增加,且呈劑量依賴(lài)性,即GABA以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)VSV 感染RAW264.7細(xì)胞系(圖3)。

RT-qPCR analysis of VSV RNA in RAW264.7 cell line pre-treated with the indicated dose of GABA and then infected with VSV for 8 hours; *P< 0.01,**P< 0.001 compared with GABA 0 mmol/L group.圖3 GABA對(duì)VSV感染的RAW264.7細(xì)胞系中VSV RNA水平的影響Fig 3 The effect of GABA on the level of VSV RNA in VSV-infected RAW264.7 n=4)

2.4 GABA提高 VSV感染的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中VSV RNA水平

與對(duì)照組相比,GABA預(yù)處理的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中VSV RNA水平明顯增加,且呈劑量依賴(lài)性(圖4)。

RT-qPCR analysis of VSV RNA in mouse primary peritoneal macrophages pre-treated with the indicated dose of GABA and then infected with VSV for 8 hours; *P<0.01, **P< 0.001 compared with GABA 0 mmol/L group.圖4 GABA對(duì)VSV感染的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中VSV RNA水平的影響Fig 4 The effect of GABA on the level of VSV RNA in VSV-infected mouse primary peritoneal

2.5 GABA提高VSV感染的RAW264.7細(xì)胞系中細(xì)胞因子mRNA水平

用10、30、50和70 mmol/L GABA預(yù)處理的RAW264.7細(xì)胞系在VSV感染8 h后,Ifnb1和Il-6的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組細(xì)胞相比顯著升高(圖5)。

RT-qPCR analysis of mRNA levels of Ifnb1 and Il-6 in RAW264.7 cell line pre-treated with the indicated dose of GABA and then infected with VSV for 8 hours; *P<0.05 compared with 0 mmol/L GABA group.圖5 GABA對(duì)VSV感染的RAW264.7細(xì)胞系中細(xì)胞因子mRNA水平的影響Fig 5 The effect of GABA on the mRNA levels of cytokine in VSV-infected RAW264.7 n=4)

3 討論

近年來(lái),全球范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)大規(guī)模的病毒感染,嚴(yán)重影響了人類(lèi)生命健康,因此迫切需要探究更加安全高效的抗病毒策略。宿主細(xì)胞代謝與病毒感染關(guān)系尤為密切。病毒依賴(lài)于宿主細(xì)胞為其提供復(fù)制和繁殖所需的物質(zhì)和能量,因此宿主細(xì)胞代謝水平和狀態(tài)能直接影響病毒的復(fù)制周期;同時(shí)宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生改變的代謝物還能通過(guò)影響自身抗病毒天然免疫進(jìn)而影響病毒感染和疾病進(jìn)程[8]。尋找能夠調(diào)控病毒感染的新型宿主代謝物有望為病毒感染性疾病的治療提供新思路。已有文獻(xiàn)報(bào)道在VSV和SARS-CoV-2感染的宿主細(xì)胞中,代謝物GABA含量會(huì)發(fā)生明顯上調(diào),提示GABA在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程當(dāng)中可能發(fā)揮重要作用[6-7]。基于此,本研究探究了GABA在VSV感染過(guò)程中的調(diào)控作用。

本研究發(fā)現(xiàn)10、30、50和70 mmol/L GABA不影響細(xì)胞活性,且用此劑量的GABA預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞系和小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞能顯著促進(jìn)VSV感染,并呈劑量依賴(lài)性,由此提示病毒感染所誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞內(nèi)GABA含量的上調(diào)可能起著有利于病毒自身生存復(fù)制的作用。天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御病毒感染的第一道防線,其通過(guò)誘導(dǎo)IFN-I和炎性因子等一系列免疫分子的產(chǎn)生來(lái)抵抗病毒感染[9-11]。然而,在本研究中,GABA在促進(jìn)病毒感染的同時(shí),主要抗病毒細(xì)胞因子Ifnb1和Il-6的mRNA水平也升高,提示GABA促進(jìn)病毒感染可能并非通過(guò)抑制抗病毒天然免疫細(xì)胞因子Ifnb1和Il-6的mRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,本研究表明GABA能以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)病毒感染小鼠巨噬細(xì)胞,因此抑制GABA的產(chǎn)生或降低其相關(guān)代謝通路的活性可能成為治療相關(guān)病毒感染性疾病的潛在思路,然而GABA發(fā)揮促病毒作用的具體機(jī)制還需進(jìn)一步的深入探究。